DZIP1通過影響Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲

庫都斯·克依木，卡米力江·買買提明，徐 前

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部區(qū)域最常見的癌癥。它是人類10種最常見的癌癥之一，全球每年約診斷出30萬例新病例[1]。OSCC晚期診斷預(yù)后差，病死率高，盡管在放療和外科治療方面取得了一些進(jìn)展，但晚期OSCC患者仍有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，仍需努力開發(fā)更為有效的OSCC靶向療法。

Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[3]。有研究表明，β-catenin可以與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子作用以激活下游靶基因，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)乳腺癌、大腸癌、膽管癌等癌癥細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5-7]。

DAZ相互作用蛋白1(DAZ interacting protein 1，DZIP1)是一種最初在斑馬魚中鑒定出的鋅指蛋白，主要在人類胚胎干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)[8-9]。DZIP1是Hedgehog信號通路重要組成部分[10]。腸上皮中的Hedgehog信號抑制Wnt信號通路，從而抑制Wnt靶基因在干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的表達(dá)[11]。Shi等[12]證明DZIP1是膀胱癌組織中差異化表達(dá)的基因之一，并且可能對Wnt信號通路具有調(diào)控作用。最新研究證明，DZIP1是OSCC癌組織中差異化表達(dá)基因之一，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。綜上所述，本研究旨在探究DZIP1是否通過Wnt/β-catenin信號通路對口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生影響，以期為OSCC治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)和人OSCC細(xì)胞系TSCCA、Tca8113和SCC25購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；0.25%胰蛋白酶溶液購自Gibco公司；PrimeScript RT Master Mix、SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自Takara公司；siRNA-DZIP1(si-DZIP1-1、si-DZIP1-2)和NC(negitive control)序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；Transwell小室、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；Matrigel購自BD公司；結(jié)晶紫染液、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒購自Solarbio公司；RIPA裂解液購自Beyotime公司；兔抗DZIP1抗體購自GeneTex公司；鼠抗β-catenin、Cyclin D1、c-Myc、GAPDH抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物；CCK-8購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；LiCl(Wnt/β-catenin信號通路激活劑)購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸凍存的HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞系，隨后將各細(xì)胞系轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天，接種SCC25細(xì)胞于6孔板中，密度為4×105個/mL，每孔2 mL。按照分組：NC組(陰性對照組)、si-DZIP1組(si-DZIP1-1、si-DZIP1-2)、LiCl組和si-DZIP1+LiCl組，配制反應(yīng)混合液。溶液A：240 μL Opti-MEMI減血清培養(yǎng)基+10 μL Lipofectamine 2000，室溫孵育5 min；B：Opti-MEM與待轉(zhuǎn)染物混合(NC、si-DZIP1-1、si-DZIP1-2終濃度為50 nmol/L，LiCl終濃度為10 mmol/L[14])，總體積為250 μL，室溫孵育5 min。將A液和B液混合，室溫孵育20 min。將混合液加入6孔板內(nèi)，輕輕混勻，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染序列見表1。

表1 轉(zhuǎn)染序列Tab.1 Transfection sequences

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol法提取HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞總RNA，并使用PrimeScript RT Master Mix將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 30 s；95℃ 15 s。其中GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)所需引物見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物Tab.2 Primers required for real-time PCR

1.2.4 Western blot 收集HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞(或轉(zhuǎn)染后的SCC25細(xì)胞)，RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解細(xì)胞，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離。將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入一抗DZIP1(1∶1 000)、β-catenin(1∶5 000)、Cyclin D1(1∶2 000)、c-Myc(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)，4 ℃過夜孵育，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影、曝光。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 0.25%胰蛋白酶消化液消化SCC25細(xì)胞，含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將SCC25細(xì)胞接種于6孔板中(1×103個/孔)，37 ℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)2周。PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色10 min。PBS洗滌細(xì)胞，晾干，拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 待SCC25細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化液消化細(xì)胞，制成密度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，向孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃、 5%CO2條件下孵育2 h。酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μL SCC25細(xì)胞懸液(5×104個細(xì)胞)加入上腔室中，下腔室加入500 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。5%戊二醛4 ℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下觀察。

侵襲實(shí)驗(yàn)：用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel(稀釋比例5∶1)。取Matrigel稀釋液加入各上腔室中，每室各100 μL，37 ℃孵育直至變?yōu)楣虘B(tài)。取100 μL SCC25細(xì)胞懸液(5×104個細(xì)胞)加入上腔室中，下腔室加入500 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。5%戊二醛4 ℃條件下固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞系中DZIP1的差異性表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞中DZIP1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與HOK組相比，人OSCC細(xì)胞系TSCCA，Tca8113和SCC25中DZIP1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著升高(圖1A、B，P<0.05)，其中SCC25細(xì)胞系中DZIP1表達(dá)的升高最為明顯，因此，選擇SCC25細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞系DZIP1 mRNA表達(dá)；B:Western blot檢測HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞系DZIP1 蛋白表達(dá)。a:P<0.05 vs. HOK組圖1 HOK、TSCCA、Tca8113和SCC25細(xì)胞系DZIP1的差異性表達(dá)Fig.1 Differential expression of DZIP1 in HOK, TSCCA, Tca8113, and SCC25 cell lines

2.2 si-DZIP1干擾效率篩選

SCC25細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-DZIP1-1、si-DZIP1-2和NC序列，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測DZIP1 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，NC組DZIP1 mRNA和蛋白表達(dá)均無明顯變化(圖2A、B，P>0.05)；與NC組相比，si-DZIP1-1、si-DZIP1-2組DZIP1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(圖2A、B，P<0.05)，其中si-DZIP1-2敲低效果更為明顯，因此，選取si-DZIP1-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，簡稱為si-DZIP1。

2.3 DZIP1促進(jìn)SCC25細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路活化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(圖3A、B，P<0.05)，LiCl組SCC25細(xì)胞中β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(圖3A、B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細(xì)胞β-catenin、Cyclin D1和c-Myc mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(圖3 A、B，P<0.05)。

A:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SCC25細(xì)胞中DZIP1 mRNA表達(dá)；B:Western blot檢測SCC25細(xì)胞中DZIP1 蛋白表達(dá)。a: P<0.05，vs. NC組圖2 si-DZIP1干擾效率篩選Fig.2 si-DZIP1 interference efficiency screening

A:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)；B:Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。a： P<0.05， vs. NC組；b： P<0.05， vs. si-DZIP1組圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)Fig.3 Detection of mRNA and protein expression of genes related to the Wnt/β-catenin signaling pathway by real-time quantitative PCR and Western blot

2.4 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)SCC25細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞活力，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組細(xì)胞活力顯著降低(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞增殖能力顯著降低(圖4B，P<0.05)，LiCl組細(xì)胞活力顯著升高(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞增殖能力顯著升高(圖4B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細(xì)胞活力顯著升高(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞增殖能力顯著升高(圖4B，P<0.05)。

2.5 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)SCC25細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，與NC組相比，si-DZIP1組細(xì)胞遷移能力顯著降低(圖5A，P<0.05)，細(xì)胞侵襲能力也顯著降低(圖5B，P<0.05)，LiCl組細(xì)胞遷移能力顯著升高(圖5A，P<0.05)，細(xì)胞侵襲能力也顯著升高(圖5B，P<0.05)；與si-DZIP1組相比，si-DZIP1+LiCl組細(xì)胞遷移能力顯著升高(圖5A，P<0.05)，細(xì)胞侵襲能力也顯著升高(圖5B，P<0.05)。

3 討 論

OSCC是全球10種最常見的癌癥之一，占頭頸部癌癥的80%～90%，具有免疫抑制性[15]。OSCC的特征是角蛋白生成、鱗狀分化、生長和轉(zhuǎn)移[16]。目前的治療方法是通過外科手術(shù)輔助化療和放療。但許多患者經(jīng)治療后，仍有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[17-19]。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑可調(diào)節(jié)多種癌癥進(jìn)展，與腫瘤發(fā)生相關(guān)[20-22]。有研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中519例OSCC腫瘤和44例正常組織中DZIP1的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DZIP1是OSCC組織中失調(diào)的基因之一[13]。有研究者對膀胱癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行篩選和分類，結(jié)果顯示，DZIP1是Wnt信號通路的可能調(diào)控基因[12]。本研究旨在探究DZIP1是否通過Wnt/β-catenin信號通路對口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生影響，以期為尋找OSCC治療靶點(diǎn)提供科學(xué)資料。

研究表明，DZIP1在OSCC癌組織和人OSCC細(xì)胞系中上調(diào)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13]。本研究選取多種細(xì)胞系：人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞HOK和OSCC細(xì)胞系TSCCA、Tca8113和SCC25，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測各細(xì)胞系中DZIP1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與HOK組相比，TSCCA組、Tca8113組和SCC25組中DZIP1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均顯著升高，其中SCC25組變化最明顯。

A:CCK-8檢測SCC25細(xì)胞活力；B:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞增殖能力；a: P<0.05, vs. NC組；b: P<0.05, vs. si-DZIP1組圖4 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)SCC25細(xì)胞增殖Fig.4 DZIP1 promotes SCC25 cell proliferation through the Wnt/β-catenin signaling pathway

A:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞遷移能力；B:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞侵襲能力；a: P<0.05, vs. NC組；b: P<0.05, vs. si-DZIP1組圖5 DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)SCC25細(xì)胞遷移和侵襲Fig.5 DZIP1 promoting migration and invasion of SCC25 cells through the Wnt/β-catenin signaling pathway

DZIP1是Hedgehog信號通路重要組成部分[10]。腸上皮中的Hedgehog信號抑制Wnt信號通路，從而抑制Wnt靶基因在干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的表達(dá)[11]。Shi等[12]證明DZIP1是Wnt信號通路的可能調(diào)控基因。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測SCC25細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，敲低DZIP1會抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，該抑制現(xiàn)象可被Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl逆轉(zhuǎn)，說明DZIP1介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路活化。

當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路被激活時(shí)，β-catenin聚集在細(xì)胞核中，以促進(jìn)細(xì)胞上皮表型的喪失。這個過程與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[23]。研究表明，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)可加速鼻咽癌和食道鱗癌的腫瘤進(jìn)展[24]。此外，F(xiàn)OXD2-AS1的過表達(dá)通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[25]。R-spondin 2-LGR4系統(tǒng)通過Wnt/β-catenin信號調(diào)節(jié)舌鱗狀細(xì)胞癌的生長、遷移和侵襲，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和莖樣特性[26]。本研究應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞活力，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SCC25細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，敲低DZIP1能顯著降低SCC25細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力，以上抑制現(xiàn)象均可被LiCl逆轉(zhuǎn)，說明DZIP1通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，DZIP1通過影響Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲。而有關(guān)DZIP1是否通過影響其它信號通路發(fā)揮對口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲的影響，尚需進(jìn)一步研究。