正負離子切換掃描質譜成像分析方法及其整體動物體內代謝應用研究

黃建鵬，張 錦，劉 丹，高杉杉，張瑞萍，賀玖明

(中國醫學科學院，北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

質譜成像(MSI)技術以質譜的高特異性、高選擇性和高靈敏度特點，以及可獲得的化學分子空間分布信息，成為生物學的研究前沿，特別是在醫學、生命科學和研發等領域顯示出重大應用前景[1-8]。該技術無需特殊的化學標記，通過非靶向質譜分析，不僅可同時獲得生物體中上千個分子的結構及相對含量信息，還能提供分子空間分布及其動態變化[9-10]，為理解生命活動或藥物作用的分子機制提供了直觀準確的分析手段。

早期的質譜成像可通過基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)和二次離子質譜(SIMS)技術實現。其中，MALDI-TOF MSI可對多肽、蛋白質、糖類、脂質類等生物分子進行成像。近年來隨著技術的不斷進步，MALDI-TOF MSI的檢出限已達10-18mol水平，空間分辨率優化到數個微米的水平[1-2,6]。但該技術需要添加基質，且不同結構類型的分析物對基質具有不同選擇性和離子化響應效率，從而導致該技術對小分子代謝物的檢測受到一定限制。SIMS成像技術在真空下操作，空間分辨率可達數百個納米[9]，由于能量較大，難以獲得完整的代謝物等生物分子的信息。

近年來，隨著美國普渡大學 Cooks等開發出解吸電噴霧離子化(DESI)技術，樣品在敞開環境下，無需復雜前處理的離子化新技術的研究成為質譜領域最受關注的前沿方向之一，為質譜成像技術提供了新的契機[4]，并較好地解決了生物組織樣本中代謝物的微區分布特征分析難題。DESI-MSI對生物組織中脂質類化合物和低分子量代謝物的成像分析效果好，已被用于腦、乳腺、胃腸道等不同類型腫瘤組織中代謝物的化學組成分析[10-13]。斯坦福大學的研究人員采用DESI-MSI成像技術結合組織病理信息，通過表征脂肪酸、甘油磷脂酰肌醇、甘油磷脂酰絲氨酸、硫酸腦苷酯等脂類代謝物的組成，實現了不同類型神經膠質瘤的區分[14-15]。

我國對質譜成像技術的研發和相關儀器設備的研制也日益重視，在質譜成像分析領域取得了大量突破性進展。如空氣動力輔助離子源[16]、等離子體輔助多波長激光解吸附離子源[17]、敞開式表面輔助激光解吸附離子源[18]、激光噴霧電離源[19]等均可進行質譜成像分析。本研究團隊經過十余年的協作攻關，自主研發出新型的敞開式空氣動力輔助解吸電噴霧離子化(AFADESI)技術[16]及其免標記、便捷、高靈敏和適用于定量分析的質譜分子成像技術[20-23]。隨著AFADESI-MSI技術的不斷改進和發展，成功實現了生物組織中1 500多個、涵蓋多種代謝物的高靈敏、高覆蓋質譜成像分析[24]。與此同時，將AFADESI-MSI技術與代謝組學方法相結合，創建了空間分辨代謝組學分析新方法，并成功應用于體內藥物原位表征與作用機制、腫瘤生物標志物的原位篩查及免標記分子病理診斷的研究[25-27]。

在動物各組織器官的空間分辨代謝組學研究中，一般采用正負離子模式分別掃描兩張相鄰切片的方式獲得更多代謝物信息[24,28-29]。但此方法不僅增加了樣品的消耗量，而且將樣品分析時間延長了1倍。為了提高空間分辨代謝組學的研究效率，本研究基于AFADESI技術對噴霧電壓和質譜儀數據采集方式進行調整優化，開發了一種正負離子化模式切換掃描的質譜成像方法，可用于各種類型代謝物空間分布信息的同時采集。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

大鼠肝組織切片采用冷凍切片機(CM1860 XP，Leica Biosystems)制備，小鼠整體動物切片采用冷凍切片機(CM3600 XP，Leica Biosystems)制備，組織切片采用AFADESI成像平臺及控制軟件(本課題組自主研發)和Q-Orbitrap高分辨質譜儀(Q-Exactive，Thermo Fisher Scientific)進行成像分析；噴霧溶劑采用乙腈(HPLC,Thermo Fisher Scientific公司)和純凈水(杭州娃哈哈食品有限公司)配制；動物采用乙醚(分析純，中國北京化工廠)麻醉后處死。

1.2 樣品制備

動物實驗獲得本單位動物福利倫理委員會的審批，并遵守相關管理規定。8周齡雄性BALB/C小鼠，體重16.0～18.0 g，購自中國食品藥品檢定研究院(大興)，許可證號：SCXK(京)：2017-0005。采用高濃度的乙醚麻醉處死小鼠，并置于-80 ℃超低溫冰箱儲存。以3%(g/100 mL)的羧甲基纖維素鈉包埋，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍成型，轉移至CM3600 XP冷凍切片機約1 h。設定切片厚度參數為25 μm，固定于載玻片上，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。質譜成像分析前，組織切片依次在-20 ℃真空干燥器內干燥2 h，室溫干燥2 h。SD雌性大鼠，體重180～200 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。采用高濃度的乙醚麻醉處死大鼠，立即取出大鼠肝組織，置于模具中，放入-80 ℃超低溫冰箱迅速冷凍保存。切片前轉移至CM1860 XP冷凍切片機中，切制20 μm肝組織切片，將切片吸附在正電荷防脫載玻片上，保存于-80 ℃超低溫冰箱，質譜成像分析前，在-20 ℃冷凍干燥1 h，在室溫下干燥2 h后備用。

1.3 儀器條件

正負離子化模式分別進行的質譜成像分析的噴霧電壓分別設置為±7 000 V，正負離子化模式切換同時掃描質譜成像分析的噴霧電壓設置為0 V或交流5 000 V，其他參數相同。解吸和離子化采用同軸的高壓氣體霧化液體形成帶電噴霧液滴，作用在樣品表面，噴霧毛細管內徑為100 μm，外徑為200 μm，外部鞘氣管內徑為300 μm，噴霧氣壓力為0.7 MPa，噴霧溶劑選擇乙腈-水(8∶2,體積比)，流速設置為10 μL/min。AFADESI抽氣流速為45 L/min。成像掃描采用線掃描，成像裝置移動平臺的X軸移動速度為0.35 mm/s，Y軸移動步長為0.5 mm。質譜參數設置為毛細管溫度350 ℃，掃描方式為PositiveFull Scan和/或NegativeFull Scan，掃描質量范圍設置為m/z76～1 000 Da，AGC time 100 ms，AGC target 5 e6，分辨率(Resolution)為70 000。

1.4 數據處理

使用Q-Exactive型質譜儀配套的Xcalibur 3.0軟件進行儀器控制和數據采集，并將數據從“.raw”格式轉化為“.cdf”格式。采用自主研發的MassImager質譜成像軟件進行圖像重構和背景扣除，結合相鄰切片的H&E染色圖選定小鼠不同器官區域，提取器官區域的正負離子質譜數據，并以二維數據矩陣(m/z-Intensity)的形式保存為.txt格式文件。將不同器官的質譜數據文件(.txt)導入MarkerView 1.2.1(AB SCIEX，美國)軟件中實現峰提取和峰對齊，最后將其導出為多維數據矩陣，并保存為.xlsx格式數據文件。用內源性代謝物正負離子質譜數據矩陣構建OPLS-DA模型，獲得不同器官代謝物的OPLS-DA得分圖。對內源性代謝物數據進行t檢驗，篩查P值小于0.05的差異代謝物。設置代謝物可能的準分子離子加合形式([M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M-H]-、[M+Cl]-等)，以小于5 ppm的質量誤差搜索數據庫，如：HMDB(http://hmdb.ca/)、LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org/)等，對代謝物進行標注。

2 結果與討論

2.1 噴霧電壓對離子化率的影響

將AFADESI-MSI的正負離子化模式切換同時掃描和單極性分別掃描模式，對代謝物成像分析檢測的離子化效率進行比較。設置不同的掃描采集模式，用相鄰的大鼠肝組織切片進行AFADESI-MSI分析，得到的代謝物質譜輪廓和離子強度結果(見圖1)，可以看出正負離子切換同時掃描模式未顯著降低代謝物成像檢測的覆蓋度和靈敏度，且對肝組織中代謝物的成像效果和分辨率影響也不明顯。由此表明進行組織樣品成像分析時可以將質譜儀的掃描模式設置為正負切換掃描模式，以便同時檢測到樣品的正離子和負離子質譜成像圖。

為了摸索同時正/負離子化樣品的離子源參數，設置AFADESI離子源的噴霧電壓分別為5 000 V直流電壓、-5 000 V直流電壓、5 000 V交流電壓和不加電壓。在這4種離子源條件下，對肝組織切片進行成像分析，得到的代謝物離子總數結果如圖2所示。檢測代謝物離子總數最多的是分別施加正、負直流電壓的AFADESI離子源搭配相應單極性掃描模式的質譜儀。無電壓的AFADESI離子源搭配正負切換掃描模式，檢出的代謝物離子總數與施加直流電壓的AFADESI離子源搭配正負切換掃描模式的質譜儀相近。而施加交流電壓的AFADESI離子源搭配單極性掃描模式的質譜儀檢出的代謝物離子數量最少。本研究開發的正負離子切換掃描質譜成像方法是將組織樣本中的代謝物同時解吸和離子化后(不一定實現正負電荷分離)，進入質譜質量分析器進行“正負離子切換”掃描，分別獲得正負離子的質譜圖。

圖1 相鄰肝組織在單極性掃描模式(A.負離子；B.正離子)和正負離子切換掃描模式(C.負離子；D.正離子)下檢測的AFADESI-MSI質譜圖和成像結果Fig.1 Mass spectra and MSI images of adjacent liver tissues under unipolar scan mode(A.negative；B.positive) and positive/negative ion-switching scan mode(C.negative；D.positive) by AFADESI

圖2 不同噴霧電壓和掃描模式下質譜成像檢出的代謝物總數Fig.2 Total number of metabolites detected by MS imaging under different spray voltages and scan modes

2.2 穩定性考察

選擇3個相鄰肝組織切片作為樣品，用正負離子切換掃描質譜成像方法進行代謝物檢測，代謝物成像結果見圖3。氯化鈉、葡萄糖、谷氨酸、黃嘌呤、亞精胺、甜菜堿、纈氨酸等8個內源性代謝物(4個正離子代謝物和4個負離子代謝物)在3個肝組織切片中響應強度的相對標準偏差(RSD)均小于15%。此結果表明正負離子切換掃描質譜成像方法的穩定性良好，適用于開展生物組織中代謝物的成像分布研究。

2.3 整體動物體內代謝組學分析應用

用正負離子切換掃描質譜成像方法對BALB/C小鼠的整體切片進行成像分析。根據相鄰切片的光學圖在 MassImager 軟件中與質譜成像圖匹配后，選定小鼠的腦、腎、肝、肺和脾器官區域，獲得器官區域任意6個像素點的代謝物輪廓，實現峰對齊后，將其導出為多維數據矩陣。經OPLS-DA建模分析后，獲得的結果如圖4所示。在正負離子切換掃描模式下，腦、腎、肝、肺和脾器官的內源性代謝物均具有明顯的聚類和分組趨勢，體現了內源性代謝物種類及含量分布與組織器官具有相關性和特異性。體內的內源性代謝物負責各組織器官生理功能的維持與調節，因此，不同生理功能組織器官中的代謝物種類和含量也千差萬別。對代謝物的空間分布特征的表征，可以深入理解組織器官的功能及其中的分子代謝過程和分子機制[24]。對5組器官的內源性代謝物的質譜強度數據進行t檢驗，篩選出組織器官特異性的差異代謝物(P值<0.05)，其中正離子差異代謝物149個，負離子差異代謝物182個。典型的組織器官差異代謝物成像結果展示了內源性代謝物的精準空間分布和顯著的器官濃度差異(見圖5)。上述研究結果表明，通過質譜成像對代謝物進行高通量檢測分析，能直觀呈現代謝物在不同組織器官中的濃度(質譜強度)，可尋找具有特異性空間(組織器官)分布的差異代謝物。

圖3 相鄰肝組織切片代謝物的正負離子切換掃描質譜成像圖Fig.3 Images of metabolites in adjacent liver sections was obtained by AFADESI-MSI with positive/negative ion-switching scan

根據內源性代謝物的精確質量數，對代謝物進行標注，獲得的部分結果如圖5所示。小鼠體內器官特異性代謝物有：脫氧胞苷(Deoxycytidine)、磷脂酰膽堿類代謝物PC-32∶1和PC O-38∶6、黃嘌呤核苷(Xanthosine)、N-乙酰基-L-天冬氨酸、磷脂酰甘油類代謝物PG 32∶1等。小鼠體內分布較為廣泛的內源性代謝物有：甜菜堿(Betaine)、谷氨酰胺(Glutamine)、黃嘌呤(Xanthine)等。其中谷氨酰胺在正負離子同時被檢測和成像，說明正負離子切換掃描質譜成像方法可以將代謝物同時正負離子化，極大地提高了代謝物的離子化效率。另外，大部分的內源性代謝物在成像分析過程中容易離子化為單極性離子(正離子或負離子)。上述結果表明，正負離子切換掃描質譜成像方法可同時檢測正負離子，擴展了單一樣品一次質譜成像分析對內源性代謝物的檢測范圍。

圖5 整體動物內源性代謝物的正負離子切換掃描質譜成像圖Fig.5 Positive/negative ion-switching scan MS imaging of endogenous metabolites in whole-body animalsA.optical image(光學圖像);B.imaging of positive ion metabolites(正離子代謝物成像)；C.imaging of negative ion metabolites(負離子代謝物成像)

3 結 論

本研究采用AFADESI技術開發了正負離子切換掃描的質譜成像分析方法，并通過對肝組織和小鼠整體切片的成像分析驗證了該方法。應用不同噴霧電壓和離子化模式對肝組織進行成像分析，測得的代謝物質譜數據和成像結果差異表明，正負離子切換掃描質譜成像方法對代謝物的覆蓋范圍寬，單個切片成像檢測代謝物種類更多。利用正負離子切換掃描質譜成像方法對3份相鄰肝組織切片進行成像分析，計算得到8種內源性代謝物質譜強度的RSD均小于15%，表明正負離子掃描質譜成像方法穩定可靠。小鼠整體切片的質譜成像分析結果和質譜成像數據OPLS-DA得分圖，呈現了正負離子切換掃描質譜成像方法獲得的內源性代謝物的精準空間分布和顯著的器官濃度差異。綜上所述，正負離子切換掃描質譜成像方法能夠高效、安全、穩定、精準地檢測更多種類的代謝物，是整體動物各組織器官空間分辨代謝組學研究的有力工具。