反相高效液相色譜測定枸櫞酸托法替布有關物質的方法學研究

張 婷 郭穎昕 陳偉燕 石海芹 郭燕燕

上海上藥中西制藥有限公司 （上海 201806）

枸櫞酸托法替布又名枸櫞酸托法替尼，即（3R,4R）-4-甲基-3-（甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基）-β-氧代-1-哌啶丙腈枸櫞酸鹽（C16H20N6O·C6H8O7），其化學結構如圖1 所示。

圖1 枸櫞酸托法替布的化學結構

類風濕性關節炎（RA）是一種由關節滑膜慢性炎癥、抗瓜氨酸肽抗體和類風濕因子的異常表達介導的慢性系統免疫性疾病，其臨床癥狀主要為滑膜增生、血管翳的形成、軟骨損失和關節破壞等，如不及時給予規范治療，病情可逐漸加重，最后導致畸形、關節強直和功能喪失，是臨床常見的主要致殘性疾病之一。我國類風濕性關節炎患病人數近500 萬；該病致殘率高，給社會和患者均造成沉重的負擔。

目前，針對類風濕性關節炎的治療有很多種，主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質激素類藥物、慢作用抗風濕藥、生物藥物及小分子激酶（JAK）抑制劑。JAK 屬于胞內酪氨酸激酶家族，能夠從細胞因子、干擾素和多種激素受體向細胞核傳遞信號，從而合成多種生物活性物質，影響細胞的代謝和功能，因此，激酶功能障礙則會導致造血功能障礙和免疫功能低下。在類風濕性關節炎患者的治療過程中，選用JAK抑制劑可以迅速有效地抑制炎癥細胞因子的過度表達，從而達到治療目的[1]。

枸櫞酸托法替布是第一個被批準用于人類自身免疫性疾病的小分子非受體型酪氨酸蛋白激酶抑制劑。枸櫞酸托法替布片于2012 年在美國首先批準上市，目前已在日本、俄羅斯、澳大利亞、加拿大等全球50 多個國家和地區獲得上市批準。2017 年，歐洲藥品管理局（EMA）也批準該藥用于類風濕性關節炎的治療，并對近5 000 名患者進行隨訪，其長期安全性和有效性數據得到了進一步證實。枸櫞酸托法替布的臨床療效顯著，且可與甲氨蝶呤或其他非生物改善病情抗風濕藥（DMARD）聯合使用，不良反應輕微、安全性高、服用方便，深受醫生和患者的青睞[2-3]，是近年世界范圍內銷售量增長較快的藥物之一。

枸櫞酸托法替布為化學藥物3 類藥。目前，對于枸櫞酸托法替布有關物質的測定還不夠全面。根據其合成工藝及降解機制，選取了9 種主要的已知雜質 ，包括工藝雜質 TZ1、TZ3、TZ4、TZ5、PF-05211077、PF-05287430 以及降解雜質TZ2、PF-05579970、P-05091895。為了進一步控制上海上藥中西制藥有限公司產品枸櫞酸托法替布片的質量，參考國內外相關文獻[1-7]，系統地研究分析了枸櫞酸托法替布有關物質9 種已知雜質的測定，并采用C18色譜柱、利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）建立了枸櫞酸托法替布有關物質的測定方法。依據外標法測定4 種已知雜質的含量，采用不加校正因子的主成分自身對照法測定另外5 種已知雜質。

實驗結果證實，該方法具有良好的專屬性、耐用性、穩定性，以及較高的靈敏度[4-5]，也進一步說明其適用于上海上藥中西制藥有限公司產品有關物質項的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器

AL104 電子天平、XPE105 電子天平，梅特勒-托利多國際貿易有限公司；1260 全自動高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試劑

三氟乙酸，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈，默克股份兩合公司；癸烷磺酸鈉，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。所用試劑均為色譜純。

1.3 標準品

實驗過程中所使用的標準品信息如表1 所示。

表1 標準品信息

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑［CAPCELL PAK C18MG（4.6 mm×150 mm，3 μm）或效能相當的色譜柱］，加裝捕集柱（Ghost-Buster，4.6×50 mm）；以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，加入1 mL 0.5 mg/mL 的癸烷磺酸鈉溶液，混勻）為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫。梯度程序如表2 所示。洗脫流速為0.8 mL/min，柱溫箱溫度為45 ℃，紫外檢測波長為216 nm。

表2 梯度洗脫比例

1.4.2 溶液的配制

（1）系統適用性溶液的制備

取枸櫞酸托法替布對照品及各雜質對照品適量，配制成每1 mL 中含托法替布0.15 mg，TZ1、TZ2、TZ3、TZ4、TZ5 各0.8 μg，PF-05579970、PF-05091895、PF-05287430、PF-05211077 各0.375 μg的混合溶液作為系統適用性溶液。

（2）供試品溶液的制備

稱取本品研磨細粉適量（約相當于托法替布15 mg），置于100 mL 容量瓶中；加乙腈-0.05%三氟乙酸（二者體積比為5∶95，下同）溶液振搖使托法替布溶解，放冷；加乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

（3）對照溶液的制備

精密量取供試品溶液適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL 中含0.75 μg 托法替布的溶液作為對照溶液。

（4）靈敏度溶液的制備

精密量取供試品溶液適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL 中含0.03 μg 托法替布的溶液作為靈敏度溶液。

（5）混合對照品溶液的制備

取雜質TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077對照品適量，精密稱定，用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液定量稀釋，制成每1 mL中含雜質TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 各0.3 μg 的混合溶液作為混合對照品溶液。

1.4.3 測定方法

分別取系統適用性溶液及靈敏度溶液各20 μL注入液相色譜儀，考察分離度并調節檢測靈敏度使主峰峰高的信噪比大于10；分別取供試品溶液與對照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的3 倍。采用外標法以峰面積計算供試品雜質TZ3、TZ4、PF-05091895、PF-05211077 的含量，采用自身對照法計算供試品雜質PF-05579970、PF-05287430 、TZ1、TZ2、TZ5 的含量。

2 結果與討論

2.1 系統適用性試驗

取系統適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果如表3 所示。在有關物質色譜條件下，理論板數按托法替布計為20 323，各峰間的分離度均大于2.1，說明該法色譜條件分離效果良好。

2.2 檢測限（LOD）、定量限（LOQ）試驗

精密稱取枸櫞酸托法替布標準品及各雜質適量，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液逐級稀釋，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度以主成分峰的峰高與基線噪音的信噪比大于或等于10 時對應的質量濃度為定量限；將定量限質量濃度繼續稀釋，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，以主成分峰峰高與基線噪音的信噪比大于或等于3 時對應的質量濃度為檢測限。由表4 結果可見，在該色譜條件下，各雜質檢測限均在供試品質量濃度1‰之下，說明該色譜法靈敏度較高。

表3 有關物質-系統適用性試驗結果

表4 有關物質的檢測限與定量限ng/mL

2.3 專屬性考察

稱取空白輔料約600 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量，超聲處理至分散均勻，放冷，定容、搖勻、濾過，取續濾液作為空白輔料溶液；稱取空白包衣材料約18 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入乙腈-0.05%三氟乙酸溶液適量，超聲處理至分散均勻，放冷，定容、搖勻、濾過，取續濾液作為空白包衣溶液；分別精密量取20 μL空白輔料溶液、空白包衣溶液注入液相色譜儀，結果表明輔料及包衣材料均不干擾樣品的檢測。

2.4 線性試驗

精密稱取枸櫞酸托法替布及各雜質對照品適量，分別用乙腈-0.05%三氟乙酸溶液稀釋制成一系列不同質量濃度溶液，在有關物質色譜條件下，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按上述同法進行線性回歸，結果如表5 所示。

表5 枸櫞酸托法替布及各雜質線性試驗結果

根據結果，TZ2 在0.039 8～1.593 5 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.027%～1.000%）范圍內，線性關系良好；PF-05579970 在0.037 3～1.491 6 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.025%～1.000%）范圍內，線性關系良好；TZ3 在0.039 8～1.590 4 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.027%～1.000%）范圍內，線性關系良好；PF-05091895 在0.054 7～1.457 5 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.036%～1.000%）范圍內，線性關系良好；托法替布在0.029 6～1.480 1 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.020%～1.000%）范圍內，線性關系良好；TZ1 在0.039 4～1.575 1 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.027%～1.000%）范圍內，線性關系良好；TZ4 在0.081 7～1.633 1 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.054%～1.000%）范圍內，線性關系良好；PF-05287430 在0.018 7～1.494 9 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.012%～1.000%）范圍內，線性關系良好；TZ5 在0.039 1～1.565 6 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.026%～1.000%）范圍內，線性關系良好；PF-05211077 在0.037 0～1.481 5 μg/mL（相當于供試品質量濃度的0.025%～1.000%）范圍內，線性關系良好。

2.5 溶液穩定性試驗

取本品內容物適量，按有關物質測定法制備供試品溶液，在室溫（不避光）下放置48 h 后，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩定性。結果表明，供試品溶液室溫下放置48 h 內，各雜質含量（質量分數，下同）與0 h 含量的絕對差值為0～0.02%，總雜含量的絕對差值為0.02%。因此，供試品溶液在室溫下48 h 內穩定。

2.6 重復性試驗

取本品適量，按上述方法制備供試品溶液及對照品溶液。同法操作6 份，按上述方法檢查有關物質，計算重復性試驗結果。6 份供試品溶液中：TZ2含量的均值為0.04%，相對標準偏差（RSD）為0；平均相對保留時間（RRT）為0.68 的雜質含量的均值為0.01%，RSD 為0；RRT 為0.77 的雜質含量的均值為0.01%，RSD 為0；RRT 為1.69 的雜質含量的均值為0.02%，RSD 為0.01%；RRT 為1.90 的雜質含量的均值為0.02%，RSD 為0；RRT 為2.13 的雜質含量的均值為0.02%，RSD 為0；PF-05091895 含量的均值為0.03%。6 份供試品溶液的絕對差值為0.01%，總雜含量的RSD 為4.23%，表明該測定方法具有優異的重復性。

2.7 準確度試驗

分別精密稱取各雜質10 mg 置于1 000 mL 容量瓶中，各加乙腈－0.05%三氟乙酸溶液溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，作為各個雜質儲備液。按處方量分別加入枸櫞酸托法替布及空白輔料；每種雜質分別設計3 個不同的質量濃度，各制成每1 mL 分別含雜質約0.1，0.4 和0.5 ng 的混合溶液。每個質量濃度分別配制3 份供試品溶液，按上述方法進行回收率測定，結果如表6 所示。采用該法測定的枸櫞酸托法替布各雜質9 份樣品平均回收率均在97%～104%之間，RSD 均符合接受標準，表明該方法準確度高，也進一步證實了該測定方法的精確性與可靠性良好。

表6 有關物質回收率試驗結果

2.8 耐用性試驗

按前文所述配制系統適用性溶液，按照相關測定方法，每次只改變一個色譜條件，考察該方法的耐用性，結果如表7 所示。

表7 有關物質耐用性試驗結果

由表7 可知，進樣流速、離子對試劑比例、色譜柱批號、柱溫箱溫度等在一定程度下均不影響主藥的測定，表明該方法的系統耐用性良好。

3 結語

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑［CAPCELL PAK C18MG（4.6 mm×150 mm，3 μm）或效能相當的色譜柱］，以0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相梯度洗脫，建立反相高效液相色譜法對枸櫞酸托法替布片有關物質進行檢測，該法靈敏度高、雜質分離效果好、耐用性優異，溶液質量濃度與峰面積相關性顯著，處方中輔料不干擾藥物含量的測定，且操作簡便、檢測迅速、準確度高，適用于枸櫞酸托法替布有關物質的檢測。