紅景天中熊果苷的提取和含量測定

胡英婕

錦州醫科大學醫療學院 （遼寧錦州 121000）

紅景天是《中華人民共和國藥典（一部）》收錄的中藥材，為景天科植物大花紅景天的干燥根及根莖；具有益氣活血、通脈平喘功效，用于氣虛血淤、胸痹心痛、中風偏癱、倦怠氣喘等癥[1]。紅景天的有效成分包括紅景天苷、槲皮素、山萘酚、熊果苷等[2-4]。熊果苷具有美白、去色斑、殺菌、消炎的作用，現主要用于高級化妝品的制備；因其能去除雀斑和黃褐斑，被稱為21 世紀理想的美白祛斑活性劑[5-7]。本研究以紅景天中有效成分熊果苷為研究對象，根據熊果苷提取方法的相關文獻[8-10]，采用正交試驗確定熊果苷的最佳提取方案，并建立高效液相色譜測定熊果苷含量的方法。該方法對紅景天用藥質量監控及熊果苷在化妝品和醫藥領域的開發利用提供了實驗依據。

1 試劑與儀器

紅景天藥材，經錦州成大方圓藥店主任中藥師王景清鑒定為正品；熊果苷對照品（批號：120520-201909），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙醇（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸（分析純），天津市康科德科技有限公司；重蒸餾水，自制。

FL2200 高效液相色譜儀，浙江福立分析儀器股份有限公司；ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），北京金歐亞科技發展有限公司；KQ-100A 超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；BP211D 電子分析天平（精度0.000 01 g），德國賽多利斯集團；TU-1800 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

A：乙腈－0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（二者體積比為22∶78）。實驗結果顯示熊果苷峰峰形不佳，拖尾現象嚴重。

B：甲醇-水-磷酸-三乙胺（四者體積比為47.0∶52.7∶0.2∶0.1）。實驗結果顯示熊果苷峰和前一個峰分離度差。

C：甲醇-水（二者體積比為65∶35），加磷酸調節pH=3.5。實驗結果顯示熊果苷峰保留時間過短，有拖尾現象。

D：乙腈-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者體積比為10∶90）。實驗結果顯示熊果苷峰分離度符合要求且峰形好，保留時間適中。

E：甲醇-乙腈-水（三者體積比為9∶9∶82，加0.1%三乙胺）。實驗結果顯示熊果苷峰峰形不佳，分離度小。

5 個流動相比較，D 分離效果較好，且保留時間適中，柱效高。因此選擇乙腈-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀6.8 g、三乙胺5 mL、磷酸4 mL，加水1 000 mL）（二者體積比為10∶90）為熊果苷含量測定的流動相，流速為1.0 mL/min。2.1.2 檢測波長的選擇

因熊果苷具紫外吸收，用紫外檢測器對熊果苷對照品溶液進行紫外全程掃描，其最大吸收波長在280 nm 處，因此確定熊果苷的檢測波長是280 nm。

2.1.3 柱溫的選擇

分別考察不同柱溫（10，20，30 和40 ℃）對柱效的影響：柱溫在20～30 ℃之間，熊果苷峰峰形無明顯變化，分離效果好，樣品穩定，柱效高；柱溫過低或過高，分離效果均較差。因此選擇室溫（23 ℃）為柱溫。

2.2 熊果苷對照品溶液的配制

取105 ℃干燥至恒重的熊果苷對照品5.0 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解、稀釋至刻度，即為含熊果苷0.2 mg/mL 的儲備液。

2.3 標準曲線線性范圍考察

精密吸取熊果苷對照品儲備液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00 mL，分別置于7 個25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻, 經微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，各吸取10 μL，注入高效液相色譜儀。記錄熊果苷對照品溶液的色譜圖，測定峰面積，得到進樣量（x）和峰面積值（y）的回歸方程：y=854 612x+354 124，r=0.999 0。在0.2～1.4 mg 范圍內，熊果苷進樣量與峰面積呈良好線性關系。

2.4 供試品溶液的制備

提取溶劑、每克原料所用溶劑體積、提取方法、提取時間均會對熊果苷含量測定有影響，可設計正交試驗四因素三水平表，見表1。

表1 熊果苷提取正交試驗因素水平表

取紅景天研成粉末（過3 號篩）約2 g，精密稱定，按照L9（34）正交表設計的提取方法分別進行3次重復試驗，得到熊果苷含量，結果見表2。熊果苷提取結果方差分析見表3。

以熊果苷含量為評價指標，由極差（R）可知，各因素影響作用主次為：C＞A＞D＞B。方差分析結果表明：A，C因素（提取溶劑、提取方法）影響較大，具顯著意義（p＜0.01）；B，D因素（提取溶劑體積、提取時間）影響較小，不具顯著意義（p＞0.01）。根據正交試驗結果，熊果苷最佳提取方案為A3B2C1D2，即用60%乙醇超聲提取50 min，1 g 原料需20 mL 溶劑。

綜上所述，熊果苷提取方案為：取紅景天（過3號篩）約2 g，精密稱定，用40 mL 的60%乙醇超聲提取50 min，搖勻、濾過，濾液即為供試品溶液。

表2 熊果苷提取L9（34）正交試驗分析結果

表3 熊果苷含量方差分析表

2.5 精密度試驗

精密吸取熊果苷對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣6 次，計算熊果苷含量的相對標準偏差（RSD）。RSD=0.7%，表明該方法精密度高。

2.6 重復性試驗

取同批次紅景天藥材，制備6 份供試品溶液，分別進樣10 μL，計算得到熊果苷含量的RSD=0.9%，表明該方法重復性好。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0，4，8，12，16，20，24 h 進樣，根據峰面積計算得到熊果苷含量的RSD=0.8%，表明供試品溶液在24 h 之內穩定。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的紅景天藥材1.000 克9份，分別按熊果苷含量的80%、100%、120%的量加入熊果苷對照品（三個水平，每個水平2 份），制備成加樣供試品溶液，測定熊果苷質量分數，并計算回收率，結果見表4。

表4 熊果苷加樣回收試驗結果

2.9 樣品含量測定

精密吸取不同批次供試品溶液，進樣6 次，根據峰面積計算得到熊果苷質量分數平均值為3.2 mg/g，RSD=1.0%。

3 結語

采用L9(34)正交設計優選出紅景天中熊果苷的最佳提取工藝。目前美白祛斑化妝品中使用的熊果苷多為合成品，本研究考察了從天然植物藥材紅景天中提取熊果苷的有效方法，為提取天然熊果苷提供了實驗依據，對天然熊果苷的市場開發利用具有重要意義。