染色質解旋酶DNA結合蛋白對舌鱗狀細胞癌CAL27細胞侵襲和轉移影響的研究

胡凱莉 范欣 胡溫庭 李洪利 唐清華 孫學輝

1.濰坊醫學院口腔醫學院，濰坊261053；2.濰坊醫學院附屬醫院口腔科，濰坊261000；3.濰坊醫學院附屬醫院口腔頜面外科，濰坊261000；4.濰坊醫學院醫學研究實驗中心，濰坊261053

舌鱗狀細胞癌是口腔鱗狀細胞癌最常見的類型[1]，其發展速度較快，相較于其他類型口腔鱗狀細胞癌更具有侵襲性[2]，舌鱗狀細胞癌可引起語言功能障礙、妨礙咀嚼、吞咽困難等口腔癥狀[3]。而且舌部血運豐富，活動頻繁，這些特殊的解剖結構使得癌癥轉移率高于其他類型的口腔鱗狀細胞癌[4]。

據報道[5]，早期患者預后良好，但是如果發生隱匿性轉移，患者死于疾病的風險將增加5 倍，5年生存率由85.5%下降至48.5%。Wang 等[6]的研究表明，口腔鱗狀細胞癌的復發率為32.7%，只有31.8%的復發患者可以存活5 年，而在沒有復發的患者中，79.9%可以存活5 年。因此明確舌鱗狀細胞癌的侵襲轉移機制，可為臨床上抑制舌鱗狀細胞癌的侵襲轉移提供新的靶點和實驗依據。

肝癌細胞中分離出來的染色質解旋酶DNA 結合蛋白（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L），屬于氟化亞錫2家族的亞家族[7]。該家族蛋白主要參與細胞核活動，調節轉錄，維持染色體完整性和DNA 修復[8]。CHD1L 在肝癌、食管鱗狀細胞癌和小細胞肺癌中表達異常，并且與腫瘤進展和預后具有顯著相關性[9-11]。本課題組前期實驗[12]證明，CHD1L 在乳腺癌發生發展中具有促進作用，但是CHD1L 在舌鱗狀細胞癌的表達及作用機制尚未明確闡述，因此本研究旨在探索CHD1L 在舌鱗狀細胞癌侵襲和轉移的作用，有望為臨床抑制舌鱗狀細胞癌侵襲轉移提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

Lipofectamine 2000 脂質體轉染試劑、Beyo-ClickTMEdU 細胞增殖試劑盒（上海市碧云天生物技術有限公司）；β 肌動蛋白單克隆抗體、兔抗人CHD1L、上皮鈣黏著蛋白和波形蛋白單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；人正常皮膚細胞HaCaT 由濰坊醫學院醫學研究實驗中心保存，人舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞由上海市口腔頜面部腫瘤組織樣本及生物信息數據庫專業技術服務平臺贈送。

1.2 方法

1.2.1 運用數據庫檢索CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中的表達和與頭頸鱗狀細胞癌患者預后的關系 舌鱗狀細胞癌是頭頸鱗狀細胞癌主要亞型之一[13]，因數據庫未對頭頸鱗狀細胞癌詳細分組，因此擬通過檢索CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌的表達來評估CHD1L 在舌鱗狀細胞癌的表達。Ualcan 數據庫數據源于TCGA 數據庫，是一個包括31 種癌癥、數千個腫瘤樣本的基因數據。以“CHD1L”和“Head and Neck squamous cell carcinoma（HNSC）”為關鍵詞在Ualcan 數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）檢索CHD1L 在HNSC 組織和正常組織的表達以及按淋巴結轉移數量分組后各組中的相對表達情況。通過GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）中檢索頭頸鱗狀細胞癌患者CHD1L的表達與患者生存的關系。

1.2.2 細胞培養 人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27和人正常皮膚細胞HaCaT 用含10%胎牛血清的高糖型Dulbecco 改良的Eagle 培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM），于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。CHD1L 質粒轉染方法參照文獻[14]，將CHD1L 敲除質粒和敲除對照質粒分別轉染進入人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27。將轉染后細胞命名如下：1）SiCHD1L/CAL27 組：轉入CHD1L 敲除質粒；2）Scr/CAL27 組：轉入CHD1L 敲除對照質粒。

1.2.3 蛋白質印跡檢測 為檢測人正常皮膚細胞HaCaT、人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27以及Scr/CAL-27 組細胞和SiCHD1L/CAL27 組細胞中CHD1L 的表達情況，使用裂解液將各組細胞裂解，提取總蛋白。上樣，進行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），隨后參照蛋白標記切取蛋白β 肌動蛋白、CHD1L、上皮鈣黏著蛋白和波形蛋白對應的條帶，轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。封閉，清洗，敷對應的一抗，4 ℃過夜。再次清洗后敷二抗，曝光。一抗抗體配制比例分別為CHD1L（1∶1 000）；上皮鈣黏著蛋白（1∶1 000）；波形蛋白（1∶1 000）；β肌動蛋白（1∶1 000）。

1.2.4 EdU 增殖實驗 為了分析CHD1L 對舌鱗癌細胞CAL27增殖能力的影響，使用帶有Alexa Fluor 594的BeyoClickTMEdU細胞增殖試劑盒進行EdU染色。首先用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）輕輕沖洗細胞，然后加入新鮮的常規培養基，再加10 μL EdU 工作液與培養液混勻。將細胞在37 ℃、5%CO2下孵育2 h。溫育后，再次用PBS 清洗細胞以除去培養基和游離的EdU探針。然后室溫下于4%多聚甲醛中固定15 min，PBS 清洗3 次。室溫下用含0.3% Triton X-100 的PBS孵育15 min。PBS清洗1～2次，加入200 μL 的點擊反應緩沖液、CuSO4、Azide 594 和點擊反應添加劑溶解液的混合物，孵育30 min，同時避光保存。PBS 清洗玻片，30 ℃避光條件下Hoechst 33342 染色10 min，吸出染色劑，PBS 再次洗滌后，激光共聚焦顯微鏡拍照。每組實驗重復3次。1.2.5 傷口愈合實驗 為檢測CHD1L 對人舌鱗癌細胞CAL27 遷移能力的影響，實驗將Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27 細胞懸液分別接種至六孔板中，并在完全培養基中生長至80%左右，用10 μL的槍頭沿直尺在六孔板中央劃條直線，PBS 洗滌幾次，含1%胎牛血清的培養液繼續培養。在光學顯微鏡下拍攝照片，記錄愈合過程。

1.3 統計學分析

所有實驗數據均用SPSS 20.0 統計學軟件進行處理，各組樣本間采用獨立樣本t檢驗，認為P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 數據庫檢測結果

通過Ualcan 網站分析TCGA 數據庫中CHD1L在頭頸鱗狀細胞癌組織和正常上皮組織的差異表達情況，結果與正常上皮組織相比，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌組織中表達升高（P＜0.000 1，圖1A），且淋巴結轉移數量＞9 個的頭頸鱗狀細胞癌患者的CHD1L 的表達量高于淋巴結轉移數量≤3個的患者（P＜0.05，圖1B），結果表明：CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中起著癌基因的作用，并且與淋巴結轉移有關。GEPIA 數據庫的分析結果表明：高表達組的總生存率明顯低于低CHD1L 表達組（P=0.017，圖1C）。由此可見，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌發生發展中起著重要作用而且與患者預后相關。

2.2 蛋白質印跡檢測CHD1L的表達結果

蛋白質印跡檢測結果顯示：人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中CHD1L的表達量明顯比在人正常皮膚細胞HaCaT 中的表達量高（P＜0.05，圖2 左），CHD1L 在SiCHD1L/CAL27 組細胞中的表達明顯低于Scr/CAL27組細胞中的表達（P＜0.05，圖2右）。

圖1 CHD1L在頭頸鱗狀細胞癌組織中的表達及與患者生存分析Fig 1 Expression of CHD1L in squamous cell carcinoma of the head and neck and its survival analysis

2.3 EdU增殖實驗結果

在激光共聚焦顯微鏡觀察下，EdU 陽性細胞表現為紅色，Hoechst 33342 染色細胞核呈藍色。EdU 增殖實驗檢測的結果顯示：SiCHD1L/CAL27組EdU 陽性的細胞百分比明顯低于Scr/CAL27 組，這表明在CHD1L敲除后，舌鱗狀細胞癌CAL27細胞的增殖能力明顯受到了一定的抑制（P＜0.05，圖3）。

2.4 傷口愈合實驗結果

通過對比同一視野下0 h 和24 h 的細胞照片發現，CHD1L 低表達使人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27的遷移能力明顯減弱（P＜0.05，圖4），這提示，CHD1L 在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的遷移中發揮了促癌作用。

2.5 蛋白質印跡檢測EMT相關蛋白的表達結果

蛋白質印跡檢測結果顯示：SiCHD1L/CAL27細胞的上皮鈣黏著蛋白表達量明顯高于Scr/CAL27細胞，而波形蛋白表達量低于Scr/CAL27細胞（P＜0.05，圖5）。這表明，CHD1L 通過促進人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的EMT 進而使腫瘤細胞獲得侵襲性。

圖3 CHD1L對Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27增殖能力的影響Fig 3 Effect of CHD1L on the proliferation ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

圖4 CHD1L對Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27遷移能力的影響Fig 4 Effect of CHD1L on the migration ability of Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

圖5 EMT相關蛋白在Scr/CAL27和SiCHD1L/CAL27的表達情況Fig 5 Expression of EMT related proteins in Scr/CAL27 and SiCHD1L/CAL27 cells

3 討論

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面部高發腫瘤之一，約50%左右患者可以生存5 年，但是TNM-Ⅳ期患者僅15%的患者可生存5 年[15]。據報道[16-17]，侵襲性及高轉移是腫瘤致死的主要原因，所以明確舌鱗狀細胞癌的侵襲和轉移機制有助于臨床舌鱗狀細胞癌的診治。本課題組前期研究發現，CHD1L對乳腺癌進展具有明顯促進作用，為了解CHD1L對舌鱗狀細胞癌發生發展的影響，本實驗首先通過生物信息學技術，明確了CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌的表達情況及其對患者預后的影響。通過分析TCGA 數據庫信息發現，CHD1L 在頭頸鱗狀細胞癌中的表達比在正常上皮組織內高，且CHD1L的表達與淋巴結轉移有關，該結果表明CHD1L 可能對頭頸鱗狀細胞癌的侵襲轉移有促進作用。通過分析GEPIA 數據信息顯示，CHD1L 的高表達可引起患者不良預后。

為了解CHD1L 在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中的表達情況，進一步進行了蛋白質印跡實驗，發現CHD1L在人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27中表達比在人正常皮膚細胞HaCaT 中表達量高，這與生物信息學結果的趨勢相符。為進一步了解CHD1L對人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 侵襲轉移的影響，實驗運用常規的RNA 干擾方法，敲除了人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 中CHD1L 的表達，檢測了CHD1L 對人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 增殖和遷移能力的影響，結果顯示CHD1L 表達降低后，人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的增殖能力和遷移能力明顯降低，這表明CHD1L 可以增加舌鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移能力。

EMT 使細胞之間失去細胞接觸，進而獲得遷移能力，控制癌癥的侵襲和轉移[18]。Lyons等[19]通過將不同熒光標記的EMT 細胞和非EMT 細胞混合，進行小鼠皮下注射，發現原發腫瘤的侵襲特點僅與源自EMT 細胞的腫瘤侵襲性一致，且EMT細胞協助了非EMT 細胞侵入血管。波形蛋白、鋅指轉錄因子2 和上皮鈣黏著蛋白等蛋白既是EMT激活因子又是EMT 特征性標志物，常通過檢測這些標志物的變化來反映EMT 過程[16]。有研究[20]證實，相較于癌前病變和正常上皮來說，皮膚鱗狀細胞癌細胞膜上的上皮鈣黏著蛋白表達量明顯上調。此外還有研究[21]顯示，波形蛋白和β-連環蛋白等蛋白在轉移性皮膚鱗狀細胞癌內表達上調，而上皮鈣黏著蛋白下調。Wang等[22]發現，舌鱗狀細胞癌中存在EMT，并且對舌鱗狀細胞癌細胞的侵襲轉移具有促進作用。CHD1L 最早被發現于肝癌細胞，與腫瘤的進展和患者預后具有明顯相關性[23-24]。本課題組前期實驗[12]表明，微小RNA-504靶向調控CHD1L 的表達，進而能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲。Chen等[23]通過動物實驗則發現，CHD1L 通過增加細胞運動并通過鳥嘌呤核苷酸交換因子基因介導的Cdc42，激活誘導絲狀偽足形成和EMT，來促進腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移，并且他們還在人肝癌組織侵襲性前端發現了CHD1L 表達量的增加。本實驗結果顯示，敲低CHD1L 表達后，人舌鱗狀細胞癌細胞CAL27 的EMT 相關蛋白上皮鈣黏著蛋白表達量增高和波形蛋白表達量降低，這表明CHD1L 可以促進舌鱗狀細胞癌細胞的EMT。

綜上所述，本研究結果表明CHD1L 在舌鱗狀細胞癌細胞中特異性高表達，并且能夠促進舌鱗狀細胞癌細胞EMT，進而提高腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此，CHD1L 在影響舌鱗狀細胞癌侵襲轉移方面起著重要的促進作用。此研究有望為臨床抑制舌鱗狀細胞癌的增殖、侵襲轉移提供新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。