改良第八代粘接劑對齲影響牙本質粘接性能的影響*

李小龍 余 梅 段 勁

臨床上最常見的牙體病理性改變是齲，對于齲齒的治療，最常見的方法是樹脂充填修復［1］。在牙本質齲外層的是齲感染牙本質，內層的是齲影響牙本質［2］。在牙科微創理念中，由于齲影響牙本質具有再礦化能力，因此建議去腐時保留齲影響牙本質，作為粘接的基底［3］。在牙本質齲發生的過程中，齲影響牙本質由于脫礦，形成了更高的孔隙率，同時脫礦牙本質中的膠原纖維由于酸的作用，改變了其正常的結構。因此，齲影響牙本質與正常牙本質在結構及成分含量上存在本質上的不同［4］。

在齲發生的過程中，由于齲影響牙本質發生了脫礦，導致齲影響牙本質的硬度較正常牙本質低，因此粘接后，粘接劑對齲影響牙本質的粘接強度也較正常牙本質低［5］。另外，齲影響牙本質的病理過程伴隨著再礦化，沉積的礦物質會堵塞牙本質小管，降低了粘接劑中樹脂單體對齲影響牙本質小管的滲透能力，粘接后形成的樹脂突長度及微鎖結強度也會下降［6，7］。因此提高樹脂粘接劑對齲影響牙本質的粘接強度在臨床上有著重要的意義。

在自酸蝕粘接劑的粘接過程中，酸蝕與樹脂單體滲透的過程同時進行，因此玷污層并沒有被去除，樹脂單體和改良的玷污層最終形成混合層［8］。由于樹脂滲透深度與酸蝕深度并不匹配，因此，在混合層與脫礦牙本質之間形成了一層裸露的膠原纖維，即微滲漏。微滲漏中的膠原纖維容易被牙本質內源性基質金屬蛋白酶（MMPs）及內源性水分所酶解和水解。由于齲影響牙本質存在脫礦現象，粘接后形成的混合層也較正常牙本質厚，因此在齲影響牙本質中形成的混合層更加容易被酶解及水解［9］。如何抑制酶解及水解作用，增加粘接耐久性，也是各國研究者對粘接劑研究的重點。

EGCG是一種綠茶提取物，是綠茶多酚的主要活性物質，具有抗氧化作用，MMPs 酶抑制作用等［10］。研究表明EGCG可以有效抑制體內MMPs的活性，在抑制腫瘤細胞轉移中發揮著顯著效果［11］。同時，EGCG也是一種膠原蛋白交聯劑，可以提高膠原蛋白的交聯度，降低水解作用［12］。因此，作為一種天然的MMPs抑制劑，EGCG是否能提高SBU對齲影響牙本質的粘接性能是本實驗研究的內容。

1.材料與方法

1.1 材料Single Bond Universal（3MESPE，美國）；P60（3MESPE，美國）；EGCG（Sigma，美國）；中齲離體牙；微拉伸儀（Bisco，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）；慢速線性切割機（Struers，丹麥）；齲指示劑（Voco，德國）；光固化燈（3MESPE，美國）；體視顯微鏡（Leica，德國）；掃描電鏡（電子株式會社，日本）。

1.2 方法

1.2.1 配置試劑 配置含有終濃度為100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml EGCG 的SBU 粘接劑，以不含EGCG的SBU粘接劑為對照組。

1.2.2 粘接強度測試 在齲指示劑下制備齲影響牙本質。將制備好的離體牙隨機分組，按照分組進行粘接，上方堆塑樹脂。用慢速線性切割機在流動水下沿牙體長軸進行切割，制備微拉伸試件（0.9mm×0.9mm）。在體視顯微鏡下將有粘接缺陷試件排除。將試件浸泡于超純水中24h。在微拉伸儀下進行檢測，計算微拉伸強度。

1.2.3 斷裂界面觀察 將所有微拉伸后斷裂試件在掃描電鏡下觀察斷裂界面的顯微結構。

1.2.4 微滲漏檢測 收集人中齲離體牙，按照實驗2方法進行牙齒處理及粘接，用慢速線性切割機在流動水下沿牙體長軸進行切割，制備成約1mm厚度牙本質試件。將試件浸泡于含有1%羅丹明-B-異硫氰酸酯的50%乙醇溶液中，染色24h，流動水下清洗，去除未染色的多余染料。在激光共聚焦顯微鏡下觀察微滲漏。

1.3 統計學處理方法 用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 EGCG 對SBU 粘接強度的影響 實驗組的微拉伸強度顯示于表1中。如圖所示，EGCG添加后SBU對齲影響牙本質粘接的微拉伸強度明顯提高（P＜0.0001，F=17.11），隨著添加EGCG濃度的升高，SBU 對齲影響牙本質粘接強度顯著增強（P=0.0141，F=5.013）。但是EGCG 200μg/ml組與EGCG 300μg/ml組之間的粘接強度沒有統計學差異（P=0.8698）。

表1 添加不同濃度EGCG后SBU對齲影響牙本質微拉伸強度（MPa，)

表1 添加不同濃度EGCG后SBU對齲影響牙本質微拉伸強度（MPa，)

注：與對照組比較，差異有統計學意義（a，P＜0.0001；與EGCG 100μg/ml組比較差異有統計學意義（b，P＜0.05）

2.2 斷裂界面微觀形態觀察 斷裂界面觀察的冷場發射掃描電鏡圖片顯示于圖1中。如圖所示，在對照組中，斷裂界面位于混合層下層，在圖中可以觀察到空虛的牙本質小管，樹脂突從牙本質小管內完全脫離，同時可以觀察到齲影響牙本質小管中沉積物，牙本質小管并不均一。在EGCG 100μg/ml組中可以觀察到斷裂界面位于混合層中，圖片中顯示有空虛的牙本質小管，同時也有粘接劑界面斷裂，部分樹脂突從于牙本質小管內脫離。在EGCG 200μg/ml及EGCG 300μg/ml組中，斷裂界面位于混合層上層或者樹脂層中，可見斷裂的粘接劑或者樹脂，樹脂突基本存留與牙本質小管內，樹脂突與牙本質小管的嵌合程度較高，粘接強度也較高。

圖1 微拉伸斷裂界面掃描電鏡圖片。A、對照組；B、EGCG 100 μg/ml組；C、EGCG 200 μg/ml組;D、EGCG 300 μg/ml組。圖中D為牙本質，R為樹脂，H為混合層，白色箭頭顯示空虛牙本質小管，黑色箭頭顯示有樹脂突牙本質小管。

2.3 粘接微滲漏結果 粘接界面激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示于圖2中。如圖所示，齲影響牙本質粘接界面并不均勻一致。與對照組相比較，添加了EGCG后粘接界面微滲漏明顯減少，隨著EGCG濃度的升高，粘接界面微滲漏持續減少。但添加200μg/ml及300μg/ml濃度EGCG間沒有明顯區別。

圖2 微滲漏激光共聚焦圖片。A、對照組；B、EGCG 100 μg/ml組；C、EGCG 200 μg/ml組;D、EGCG 300 μg/ml組。圖中D為牙本質，R為樹脂，白色箭頭顯示微滲漏。

3.討論

齲齒是口腔臨床上最常見的病理性改變，齲影響牙本質是口腔粘接修復最常見的粘接基底。在齲齒發生的過程中，齲影響牙本質發生部分脫礦，孔隙率增高，因此，在齲影響牙本質中形成的混合層較正常牙本質厚，更加容易被牙本質內激活的MMPs酶解，降低粘接耐久性［4,13］。另外，齲影響牙本質發生再礦化現象，抗酸性礦物沉積于牙本質小管中，同時伴隨著脫礦牙本質膠原纖維結構的改變，不利于樹脂粘接劑的酸蝕，降低粘接劑樹脂單體對脫礦牙本質的滲透［7］。上述原因影響了樹脂粘接劑對齲影響牙本質的粘接性能，降低粘接強度［6］。同時，牙本質內固有水分也較容易水解粘接后的膠原纖維層，影響粘接耐久性［14］。因此，如何提高樹脂粘接劑對齲影響牙本質的粘接強度及粘接耐久性是口腔臨床上的一大挑戰［9］。

為了提高樹脂粘接劑對正常牙本質的粘接強度，在國外研究中有研究者將EGCG預處理后進行全酸蝕或者自酸蝕粘接劑的粘接，發現可以提高粘接劑的粘接強度［15］。但是沒有研究將EGCG直接混入第八代粘接劑中，研究EGCG是否能提升第八代粘接劑SBU的粘接強度及EGCG對SBU的理化性能是否會有影響。在本實驗中發現，添加EGCG后，SBU對齲影響牙本質的粘接強度明顯提升。EGCG作為一種天然交聯劑，可通過氫鍵或者疏水鍵與脫礦牙本質膠原纖維結合，形成不溶性復合物，維持膠原纖維的結構穩定，提高酸蝕后樹脂單體對牙本質膠原纖維及小管的滲透能力，形成更加穩定的牙本質-樹脂微鎖結，以及形成更加穩定的牙本質小管-樹脂突復合體，從而提升樹脂粘接劑對齲影響牙本質的粘接強度［14］。

粘接界面的降解是由兩種機制引起，一種是混合層中樹脂粘接劑的水解作用，另外一種是混合層中裸露膠原的酶解作用。內源性基質金屬蛋白酶，特別是MMP-2/MMP-9在齲發生或者酸蝕的過程中被激活，從而產生溶膠原活性［16］。為了克服酶降解的問題，合成MMPs抑制劑，如氯己定或天然類型，如原花青素，已被提出用于處理齲影響牙本質或者正常牙本質，延緩混合層的降解，保持混合層的穩定性，增加粘接耐久性［17，18］。EGCG作為一種天然的MMPs抑制劑，在抗腫瘤活性及抗氧化作用中被廣泛研究［19］。EGCG在體內有較強的MMP-2/MMP-9抑制活性。因此，國內外研究者也正在研究EGCG作為一種MMPs抑制劑是否能提高粘接劑混合層的抗酶解作用，穩定混合層的結構，提高粘接耐久性。在Santiago的研究中發現，EGCG預處理可以提高樹脂粘接劑對正常牙本質的粘接耐久性［20］。本實驗結果顯示，SBU添加EGCG后可明顯降低形成混合層的微滲漏，有利于抑制牙本質內源性的酶解作用及水解作用，保持脫礦牙本質膠原纖維的穩定性。EGCG的酶抑制作用機制仍不完全明確，有研究提出MMPs的激活依賴于鋅離子的，多酚類物質有較強的金屬離子螯合作用，因此，EGCG有可能是通過與鋅離子的螯合作用，抑制MMPs活性［21］。在本研究中，作者猜想EGCG也有可能是通過與鋅離子的螯合作用，抑制MMPs活性。但是EGCG是否能提高SBU對牙本質的粘接耐久性仍需后續研究進行驗證。

4.結論

EGCG作為一種基質金屬蛋白酶抑制劑和天然交聯劑，可以明顯提升齲影響牙本質中脫礦牙本質膠原纖維的交聯度，降低牙本質內源性MMPs酶和余留水分子對裸露膠原纖維的酶解和水解作用，明顯提高了SBU對齲影響牙本質的粘接強度，減少微滲漏，提升了第八代粘接劑SBU的粘接性能，對臨床有一定實際應用價值。