脊柱結核患者血清特異性循環miRNA表達水平及其臨床意義

黃志剛，馬克，劉晶

深圳市第三人民醫院骨科，廣東 深圳 518100

脊柱結核是臨床上最為常見的肺外結核病，而青壯年是脊柱結核的主要發患者群。脊柱結核發展到晚期時通常會發生脊柱畸形和脊髓神經功能損傷，對患者的日后生活造成嚴重影響[1]。脊柱結核患者的臨床及影像學檢查結果均無特異性表現，且缺乏特異性實驗室檢查指標，現有的各種診斷手段難以滿足早期診斷脊柱結核的需求。

微小RNA(miRNAs)作為高度保守的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核細胞中，在細胞的生長、分化、凋亡以及機體神經、免疫、內分泌系統的代謝過程中均能夠發揮生物調節作用[2-3]。有研究表明，結核病患者的體內存在miRNAs 的異常表達，可能與結核病的發生、發展密切相關，差異化表達的miRNAs可作為早期診斷結核病的生物學指標應用于臨床[4]。為此，本研究從脊柱結核患者的外周血血清尋找存在差異化表達的miRNA，通過對比其在脊柱結核患者手術治療前后的表達變化，旨在探討將其作為早期診斷脊柱結核病和評價臨床療效的有效標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月至2018年9月在深圳市第三人民醫院住院治療的50例脊柱結核患者作為觀察組，其中男性29 例，女性21 例；年齡25～51 歲，平均(41.83±7.95)歲。納入標準：(1)經手術或穿刺明確證實為活動期脊柱結核，并最終在本院完成手術治療，病灶徹底清除，術后1年內完全治愈；(2)同時具備有較大寒性膿腫、嚴重骨質破壞者；(3)結核桿菌培養陽性，和/或病理學檢查顯示干酪樣物質者；(4)排除合并脊柱外結核者。選取同期在我院體檢的50例健康志愿者50例作為對照組，其中男性31例，女性19例；年齡28～49歲，平均(42.02±8.21)歲。所有對照組受檢者結核菌素(PPD)試驗與IFN-γ Elispot 檢測結果均為陰性。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受檢者均詳細知情并簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及提取miRNAs 采用血清收集管采集觀察組患者術前、術后1 年以及對照組受檢者的空腹外周血各2.5 mL，室溫下靜置1 h 至血液凝固。之后將凝固的新鮮外周血在4℃的環境下進行離心10 min(1 700×g)，收集上層血清，期間注意避免觸及血凝塊，之后將采集的血清在4℃環境下再次離心10 min(2 000×g)取上清液，經低速離心去除沉淀成分后將血清置于-20℃或-80℃冰箱中保存待測。采用mirVanaTMPARISTMKit將循環miRNAs提取出來，質檢miRNAs，并檢測其完整性。

1.2.2 篩選miRNAs 對芯片進行預雜交，吸除后注入雜交液，置入雜交爐中，并旋轉雜交。按照芯片數目，分裝后，將雜交液移除，根據芯片類型不同，注入同等體積的Wash Buffer A，清洗染色，掃描芯片，掃描時間由芯片類型不同而異，一般在5～15 min。聚類分析miRNAs 基因芯片。比較組間結果，按照差異倍數≥2倍，P＜0.05，篩選有顯著差異的miRNAs。

1.2.3 qRT-PCR 驗證 采用實時定量PCR 擴增(qRT-PCR)技術，分別檢測miRNAs的表達水平。采用莖環結構的MegaplexTMRNA 逆轉錄引物混合物進行。針對每一miRNA，設計反向引物，混合后再進行逆轉錄，獲得含相同莖環結構的總cDNA混合物，最后行PCR反應成功擴增，形成22 bp左右成熟體miRNA。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNAs 的表達譜芯片及qRT-PCR 驗證分析 篩選出17 個有顯著性差異的miRNA，見表1，其中顯著下調的miRNA有16個，顯著上調的miRNA有1個。聚類分析后，獲得聚類分析熱圖，見圖1。

表1 miRNAs的表達譜芯片及qRT-PCR驗證分析

圖1 miRNAs聚類分析熱圖

2.2 兩組受檢者的血清特異性循環miRNAs 表達水平比較 觀察組患者術前的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表達水平明顯低于對照組，hsa-miR-210-3p 表達水平明顯高于對照組，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 手術前后脊柱結核患者的血清特異性循環miRNAs 表達水平比較 觀察組患者在術后1 年的hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-532-5p 表達水平明顯高于術前，hsa-miR-210-3p 表達水平明顯低于術前，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 兩組受檢者的血清特異性循環miRNAs表達水平比較()

表2 兩組受檢者的血清特異性循環miRNAs表達水平比較()

組別觀察組對照組t值P值例數50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 11.35±3.08 22.422＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.72±1.13 18.364＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 5.29±1.49 15.731＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 4.11±1.28 13.961＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.28±0.31 13.573＜0.05

表3 手術前后患者血清特異性循環miRNAs表達水平比較()

表3 手術前后患者血清特異性循環miRNAs表達水平比較()

時間術前術后1年t值P值例數50 50 hsa-miR-30c-5p 1.48±0.45 10.31±2.29 26.754＜0.05 hsa-miR-432-5p 1.67±0.32 4.01±1.22 13.119＜0.05 hsa-miR-192-5p 1.84±0.43 4.69±1.17 16.167＜0.05 hsa-miR-532-5p 1.49±0.35 3.52±0.87 15.307＜0.05 hsa-miR-210-3p 3.92±1.34 1.86±0.47 10.258＜0.05

2.4 不同miRNA 表達對脊柱結核的診斷效能 hsa-miR-30c-5p 診斷脊柱結核的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值明顯高于hsa-miR-432-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-532-5p和hsa-miR-210-3p，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 不同miRNA表達對脊柱結核的診斷效能

3 討論

臨床研究發現，脊柱結核主要通過臨床表現、影像學表現及各類結核病等實驗室檢查進行綜合性診斷。然而，脊柱結核患者的各項臨床表現以及相關影像學特征與化膿性感染、真菌性感染以及骨腫瘤類似，診斷準確度較低。細菌培養作為臨床診斷結核病的重要方式，其在脊柱結核的陽性率僅有50%左右，且檢查過程耗時較長(6～8周)，難以在術前獲得培養標本[5]。多種因素導致細菌培養在診斷脊柱結核上的效果并不理想[6]，目前尚無特異性診斷脊柱結核的方法[7]。因此，快速、簡便、特異性和敏感性高的診斷措施十分迫切。

近年來研究證實，miRNA不僅參與了細胞的多個生理生化過程，同時在癌癥、感染及自身免疫疾病多種疾病中也發揮著較為重要的作用[8-10]。與細胞內miRNA相比，循環miRNA具有更好的生物學特性，可應用于肺結核以及其他多種疾病的臨床診斷中，是一種較為理想的生物標記物[11-13]。

本研究在脊柱結核病患者血清中篩選出17 個有顯著的差異表達的miRNA，經過qRT-PCR 驗證，有5個表達量顯著異常。通過對比兩組受檢者以及脊柱結核患者在手術前后的血清特異性循環miRNAs表達水平發現，患者術前的4個miRNA表達水平明顯低于健康體檢者，剩余1 個的表達水平明顯高于健康體檢者。脊柱結核在術后1年的4個miRNA表達水平明顯高于術前，剩余1個的表達水平明顯低于術前，與芯片結果一致。通過對上述的5個miRNAs靶基因進行預測，hsa-miR-30c-5p 與脊柱結核密切相關，在骨代謝中發揮較為重要的作用。hsa-miR-30c 的潛在靶基因為分別為FLT1、CXCL12、RUNX2，分別負責干細胞特性維持、MSC表型和成骨分化[14-16]。

本研究對上述5 個miRNA 在診斷脊柱結核上的診斷效能進行比較，結果顯示，hsa-miR-30c-5p 診斷的敏感度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值分別為100.00%、96.00%、98.00%、96.15%和100.00%，均明顯高于其余四個miRNA。上述5 個miRNA 中，hsa-miR-30c-5p 在診斷脊柱結核上的診斷效能最佳，其差異化表達的循環miRNAs可作為診斷的生物標志物應用于臨床。

綜上所述，脊柱結核存在特異性表達的循環miRNAs，差異化表達的miRNAs對于進一步從分子角度研究脊柱結核的病理機制、病情發展有重要作用。