不同粒徑可吸入顆粒物全身暴露對老年小鼠認知功能的影響及其機制研究

方侃，胡懷明，姜華軍，艾志兵，周圓

湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部1、神經內科2，湖北 十堰 442000

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿、以認知功能進行性衰減為主要表現的中樞神經退行性疾病，已成為全球性的公共衛生問題。其發病機制尚不清楚，亦無特效的治療藥物。但可以肯定的是AD 最主要的危險因素是老齡化和衰老，而環境因素對AD 發生發展及患病后治療效果的影響越來越成為關注焦點。可吸入顆粒物(PM)[1-3]又稱懸浮粒子，指在氣體介質中沉降速度可以忽略的小固體粒子、液體粒子及其懸浮體系。按其空氣動力學直徑PM 分為4 類：總懸浮顆粒物(≤100 μm，TSP)、粗顆粒物(≤10 μm，PM10)、細顆粒物(≤2.5 μm，PM2.5)、超細顆粒物(≤0.1 μm，UFPs)。國家《空氣質量準則》限定PM2.5年均值≤35 μg/m3、日均值≤75 μg/m3。當PM2.5、UFPs進入人體過多時，不僅對呼吸系統、心血管系統等器官產生急性毒性作用，而且破壞血腦屏障(BBB)進入大腦，引發神經損害和退行性病變。并且，這些顆粒物對老年人的易感性更強，在老年人體內沉積率更高，更容易過度激活老年機體的炎癥反應和氧化應激系統[4-6]。少數研究提示，PM2.5和UFPs暴露與AD的發生有一定的相關性，且PM的生物學效應受到其粒徑的影響[1-3，7]。為此，本研究模擬PM進入人體的正常途徑，探討不同粒徑PM 全身暴露對老年小鼠認知功能的影響及其作用機制，為揭示AD 的發病機制和防治方法提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒(南京建成)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性檢測試劑盒(碧云天生物)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)、乙酰膽堿(ACh)、膽堿乙酰轉移酶(ChAT)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢博士德)；核轉錄因子κB(NF-κB)ELISA 試劑盒(藍基生物)。DLPI-30 型低壓沖擊儀+顆粒物采樣器(芬蘭DEKATI)；HOPE-MED 8050 型動態氣溶膠染毒暴露系統(天津合普)；Nicomp 380 N3000 Basic 納米激光粒度儀(奧法美嘉)；MT-200 水迷宮行為學跟蹤系統(成都泰盟)。

1.2 實驗動物及其分組 健康昆明小鼠100 只，雄性，16 個月齡，體質量50～55 g，SPF 級，購于湖北醫藥學院實驗動物中心[SYXK(鄂)2016-0031]。在實驗前小鼠適應性喂養2 周，飼養環境：SPF 級，光暗交替(12 h/12 h)，室內溫度(22±2)℃，相對濕度(50～60)%，自由飲食。按數表法將小鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水組、PM10染毒組、PM2.5染毒組、UFPs染毒組，每組20 只。本實驗依照國家動物保護相關法規規定實施，并獲得醫院倫理委員會批準(批號：1811011)。

1.3 PM采樣及其染毒液的制備

1.3.1 PM采樣采樣地點 十堰市人民南路32號十堰市太和醫院感染性疾病治療中心樓頂；采樣點數量：1個；采樣高度：距離地面20 m；采樣時間：2018年12月25日至2019年6月25日。使用DLPI-30型低壓沖擊儀+顆粒物采樣器。此儀器可以對空氣中粒徑大小(16 nm～10 μm)不同的顆粒物進行分級(13 級)收集。該13 級切割粒徑(μm)與本實驗PM10、PM2.5、UFPs 的對應關系厘定為，PM10：4.02、6.63、10.02；PM2.5：0.157、0.264、0.385、0.618、0.955、1.61、2.41；UFPs：0.028 5、0.056 3、0.094 6。

1.3.2 染毒液制備 采樣后，將濾膜剪成(1 cm×1 cm)左右的小塊，放入50 mL 的PVC 離心管中，加20 mL生理鹽水浸泡，超聲震蕩30 min，重復4次；用6層紗布過濾振蕩液，之后對濾液冷凍真空干燥，稱重后4℃冷藏備用。暴露時，用無菌生理鹽水將PM10、PM2.5、UFPs粉末分別配制成0 mg/mL、0.146 mg/mL、0.292 mg/mL、0.584 mg/mL 的懸液，并使用納米激光粒度儀檢測懸液顆粒物大小。染毒前超聲分散。

1.4 不同粒徑PM 全身暴露染毒 國家《空氣質量準則》限定PM2.5 日均值≤75 μg/m3。本實驗取其20 倍濃度為標準(1 500 μg/m3)，即小鼠每天平均吸入PM 1.46 mg/kg，采用動態氣溶膠染毒暴露系統對PM10、PM2.5、UFPs 染毒組小鼠實施全身暴露染毒。方法：將PM10、PM2.5、UFPs懸液按組分別加入標準配氣發生器，溫度恒定在(22±2)℃，使用PM質量濃度實時監測儀，動態監測暴露艙內的PM濃度，調節進氣/載氣的流量，控制艙內PM濃度穩定在(1 500±10)μg/m3，每天吸入12 h，連續4 周。生理鹽水組小鼠霧化吸入等劑量生理鹽水，正常對照組不做任何處理。

1.5 檢測指標及其方法

1.5.1 Morris 水迷宮實驗 連續吸入染毒4 周后，行水迷宮訓練和測試。①獲得性實驗：隨機從東/西/南/北4 個起始位置之一，將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到水下平臺的時間(s)，即潛伏期(IP)；若IP 超過60 s，以60 s 計，并引導小鼠至平臺，讓其在平臺上停留10 s。4 次/d，兩次間隔15 min，連續訓練5 d。②探查實驗：在獲得性實驗結束的第2 天，將平臺移除，從原平臺對側象限將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內進入原平臺象限的次數(ENT)及在該象限探查的時間(PT)。

1.5.2 標本制備 行為學測試完畢，斷頭取腦，分離出大腦皮質和海馬體，電子天平稱重，按10 mL/g添加冷生理鹽水，用玻璃勻漿器分別制成大腦勻漿；將勻漿液置于離心機(轉速10 000 r/min，4℃)中離心10 min，收集上清液，分裝于EP 管并分別標記，置于-80℃冰箱冷凍待測。

1.5.3 大 腦 勻 漿TNF-α、IL-6、IL-1 β 含 量 及Caspase-3 活性檢測 從冰箱中取出一部分大腦勻漿上清液，平衡溫度后，按照各試劑盒(比色法)說明步驟進行操作；最后用分光光度計檢測各管吸光度，分別計算出TNF-α、IL-6、IL-1β含量及Caspase-3活性。

1.5.4 大腦勻漿SOD、GSH-Px活性、MDA和Ach含量與ChAT活性及NF-κB含量測定 從冰箱中取出另一部分大腦勻漿上清液，按各試劑盒(ELISA)說明，測定上清液中SOD、GSH-Px 活性、MDA 含量和Ach含量與ChAT 活性及NF-κ B 含量。酶標儀型號：Multiskan MK3美國熱電全自動酶標儀。

1.6 統計學方法 雙盲錄入實驗數據，建立實驗結果數據庫；采用SPSS25.0 軟件進行統計分析；計量資料以均數±標準差()描述，五組間數據比較使用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 法；檢驗水準均為α=0.05。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五組小鼠Morris 水迷宮測試結果比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠IP、ENT、PT 變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組IP 明顯延長、ENT 明顯減少、PT 明顯縮短，差異有統計學意義(P＜0.05)；與PM2.5 染毒組比較，UFPs 染毒組小鼠IP 明顯延長、ENT 明顯減少、PT明顯縮短，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 五組小鼠Morris水迷宮測試結果比較(

表1 五組小鼠Morris水迷宮測試結果比較(

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

只數20 20 20 20 20 PT(s)26.58±2.09 25.96±2.92 24.87±3.72 22.48±2.63a 20.21±3.04b 3.824＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P值IP(s)12.36±1.24 11.87±2.48 12.52±3.06 16.34±4.24a 19.82±3.48b 4.253＜0.05 ENT(次)5.37±0.43 5.50±0.84 5.19±0.77 4.26±1.38a 3.32±0.95b 3.437＜0.05

2.2 五組小鼠大腦勻漿TNF-α、IL-6、IL-1β及NF-κB 表達水平比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠大腦皮質和海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與PM2.5染毒組比較，UFPs染毒組小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 表達水平亦明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

2.3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px 活性及MDA 含量比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10染毒組小鼠大腦皮質和海馬組織SOD、GSH-Px活性及MDA含量變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，而PM2.5染毒組小鼠SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA 含量明顯提高，差異有統計學意義(P＜00.05)；與PM2.5 染毒組比較，UFPs 染毒組小鼠SOD、GSH-Px 活性明顯降低、MDA 含量明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較()

表3 五組小鼠大腦勻漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較()

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

MDA(ng/mL)17.93±1.57 18.53±2.33 19.66±3.88 24.55±2.24a 32.26±3.65b 3.215＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P 值只數20 20 20 20 20 SOD(IU/mL)2.23±0.19 2.17±0.23 2.11±0.26 1.68±0.54a 1.23±0.67b 3.078＜0.05 GSH-Px(IU/mL)37.87±2.86 38.45±3.17 36.72±4.25 28.56±2.71a 22.56±3.87b 3.679＜0.05

2.4 五組小鼠大腦勻漿Ach含量與ChAT活性及Caspase-3 活性比較 與正常對照組比較，生理鹽水組、PM10 染毒組小鼠大腦皮質和海馬組織Ach 含量與ChAT活性及Caspase-3活性變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，而PM2.5 染毒組小鼠Ach 含量和ChAT活性明顯降低，Caspase-3活性明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與PM2.5染毒組比較，UFPs染毒組小鼠Ach含量和ChAT活性明顯降低，Caspase-3活性明顯提高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 五組小鼠大腦勻漿Ach 含量與ChAT 活性及Caspase-3 活性比較()

表4 五組小鼠大腦勻漿Ach 含量與ChAT 活性及Caspase-3 活性比較()

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與PM2.5染毒組比較，bP＜0.05。

Caspase-3(kU/g)357.54±22.65 355.63±27.19 360.54±30.53 412.67±33.29a 461.51±23.68b 3.348＜0.05組別正常對照組生理鹽水組PM10染毒組PM2.5染毒組UFPs染毒組F值P值只數20 20 20 20 20 Ach(μg/mL)204.29±13.53 205.13±15.26 201.95±18.52 183.96±10.64a 170.58±14.23b 4.025＜0.05 ChAT(U/g)90.13±7.25 89.64±6.49 88.24±5.43 64.77±4.33a 52.07±3.62b 3.549＜0.05

3 討論

本研究結果顯示，與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組IP明顯延長、ENT明顯減少、PT明顯縮短，即PM2.5、UFPs全身暴露可以導致老年小鼠認知功能障礙，以后者為甚。這與王昊等[1]、孔玲等[8]、AILSHIRE等[9]綜述分析結果一致。劉旭東[2]、卞晶晶[10]研究表明，隨著PM2.5 染毒濃度的提高，大鼠出現認知能力下降并逐漸加重。王蛟男[11]、AARóN 等[12]流行病學調查亦證實，環境PM2.5 暴露與老年人認知功能障礙高度關聯。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs 染毒組大腦皮質和海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB 等炎癥反應指標的表達水平明顯提高；與李春艷[13]研究結果一致。蘇瑞軍等[14]研究，從鼻滴入20 μL 6 mg/mL PM2.5溶液，1 次/2 d，連續30 d，可減輕小鼠腦重量，上調腦炎癥因子的表達。馮德達[15]研究中經氣管滴注PM細顆粒物(37.5 mg/kg)染毒，隔天1次，共3次，大鼠大腦皮質、海馬TNF-α、IL-6、IL-1β、NF-κB表達水平明顯提高。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組大腦皮質和海馬組織SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA含量明顯提高。張克婷等[16]研究中，PM1.0染毒7 d后，誘發大鼠腦皮層氧化應激反應，SOD、GSH-Px表達明顯下調、MDA表達明顯上調，支持本研究結果。張海涯[17]研究中，妊娠期和哺乳期PM2.5 暴露，6 h/d，大鼠出生60 d后海馬組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量明顯變化及學習記憶能力明顯下降。

與正常對照組比較，PM2.5、UFPs染毒組大腦皮質和海馬組織Ach含量、ChAT活性明顯降低、Caspase-3活性明顯提高；與CHENG等[18]研究結果一致。劉旭東[3]研究表明，尾靜脈分別注射6.25 mg/(kg·d)、12.5 mg/(kg·d)單壁碳納米管后，細胞凋亡因子Caspase-3 活性明顯提高。ChAT功能是將乙酰輔酶A轉移到膽堿上形成Ach；Ach 是大腦內的一種重要神經遞質，參與認知、記憶及注意力等過程。腦組織的氧化應激和炎癥反應，直接損傷神經元，或Caspase-3活化引發神經元凋亡，均可導致膽堿能神經損傷及Ach 含量、ChAT 活性降低[19]，從而引起小鼠認知功能障礙。

本研究結果進一步顯示，PM10、PM2.5、UFPs 對老年小鼠同等濃度、同等劑量、同等時間暴露后，對小鼠行為學、大腦炎癥反應、氧化應激、膽堿能神經損傷及細胞凋亡等各項指標的影響呈現明顯差異，差異均有統計學意義(P＜0.05)；即PM10、PM2.5、UFPs的生物學效應不同，UFPs最強，PM2.5次之，PM10最弱；人體吸氣時，PM 隨空氣進入呼吸系統，PM 粒徑越小就越容易進入深部，沉積率也越高，損傷也就越嚴重。

本實驗小鼠吸入PM10 (2.5 μm＜PM10≤10 μm)后，其大腦損傷不明顯，認知功能亦無明顯下降。可能的原因是，PM10可進入并沉積在鼻、咽、喉及氣管，尤其在氣管，隨著分泌物移動、纖毛擺動及咳嗽反射，沉積的PM10 可排出體外。PM2.5 (0.1 μm＜PM2.5≤2.5 μm)可到達終末細支氣管和肺泡，大部分沉積在肺內，主要損傷該器官。有研究報道，PM2.5與特定蛋白(ApoE、轉鐵蛋白)結合，可以穿過完整的BBB 進入大腦，激活小膠質細胞或抑制抗氧化物質，引發炎癥反應和氧化應激，損傷大腦[20-21]。另外，PM2.5 通常富集Al、Pb、Ni、Mn等成分，具有明顯的神經毒性。

然而，UFPs(≤0.1 μm)的粒徑尺度已經達到納米級，其理化性質發生了很大的變化，顯示出強烈的表面效應、尺寸效應、體積效應及隧道效應，從而呈現不同的特性。因此，一方面，UFPs 可以穿透呼吸膜或氣血屏障，并隨血液循環到腦部，直接跨過BBB 進入中樞神經系統；另一方面，UFPs 可以通過嗅球途徑進入大腦。研究發現，嗅覺信息可以通過內嗅皮層輸入到海馬，即嗅覺信息→嗅覺受體→嗅球→初級嗅皮質(前嗅核、嗅結節、梨狀皮質)→內嗅皮層→穿通纖維→海馬，從而有效激發海馬神經元[1，22-24]。而UFPs 也可以避開BBB經過這一途徑輸送到海馬，再通過海馬進入大腦。如鎘、銀、氧化鐵、氧化錳、二氧化鈦等金屬顆粒物及元素碳顆粒，可通過這一途徑在大腦蓄積。在輸送UFPs的過程中，沿路神經元和神經纖維受損，突觸丟失，引發嗅覺功能障礙；而嗅覺功能障礙可進一步影響嗅覺信息到海馬的傳遞，使內嗅皮層和海馬發生萎縮，進而導致記憶力下降。

綜上所述，UFPs通過血腦屏障和嗅覺神經傳導兩個途徑大量進入大腦，誘發嚴重的炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡，引起大腦皮質和海馬神經元廣泛損傷和認知功能明顯障礙；而PM2.5只通過穿透BBB一條途徑進入大腦，且此途徑通過量低于UFPs；故UFPs的神經毒性和生物學效應比PM2.5更強。