干擾LINC00308促進miR-634對前列腺癌細胞增殖與凋亡的影響*

魏仁波 張唯力 卓暉 楊鎰魟 熊黎強 楊鵬 魏武然 曹敏

(1.成都市第三人民醫院泌尿外科,四川 成都 610031；2.重慶醫科大學附屬第二醫院泌尿外科,重慶 400010；3.四川大學華西第二醫院男科,四川 成都 610041；4.成都市第三人民醫院病理科,四川 成都 610031；5.四川大學華西醫院泌尿外科,四川 成都 610041)

前列腺癌是男性常見癌癥，也是全世界癌癥相關死亡的主要原因之一[1]。在大多數國家或地區，新診斷出的前列腺癌病例數正在增加[2-3]。盡管目前擁有早期前列腺癌患者的治療選擇(例如手術、激素治療和放射療法等)，但對于晚期疾病患者，其5年生存率仍然很低[4]。因此，有必要描述前列腺癌發展中涉及的分子機制，以發現新穎的和重要的潛在診斷標志物與治療靶標。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)曾經被認為是轉錄噪聲，然而，它在各種水平上發揮著重要的功能，如X染色體失活，染色質重塑和轉錄抑制[5]，影響包括前列腺癌在內的許多不同癌癥類型的生物學功能。據報道，LINC00308在前列腺癌中高表達，是前列腺癌發生的重要因素[7]。但是，LINC00308在前列腺癌中的生物學功能和潛在機制仍然難以捉摸。微小RNA(microRNA，miRNA)是由19-25個核苷酸組成的小型非編碼RNA，可通過對其靶mRNA的負調控來調節多種生物過程[8]，它們已被確定為癌基因或抑癌基因來影響癌癥的發生發展。作為一種新型的腫瘤抑制因子，miR-634可以抑制子宮頸癌細胞的增殖，遷移和侵襲[9]。miR-634在胃癌組織和細胞系中的表達水平明顯低于正常鄰近組織和對照細胞，其過表達抑制胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲[10]。迄今為止，LINC00308對miR-634調控的作用尚不清楚。因此，本研究探討了LINC00308和miR-634對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響以及二者的靶向關系，為前列腺癌發病機制研究提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集了33例于2017年2月～2017年11月，在本院經手術切除的前列腺癌和相鄰的無腫瘤組織標本。所有病例均經病理學診斷確診，并且獲得標本手術前未進行任何化學療法，放射療法或其他前列腺癌治療方法。所有實驗均經醫院醫學倫理委員會批準，獲得所有患者的知情同意。將前列腺癌組織和癌旁組織立即置于液氮中，提取RNA進行實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析。

1.1.2 細胞與試劑 前列腺癌細胞系PC-3M和DU145購自美國典型培養物保藏中心，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養基購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、兔抗細胞核相關抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)抗體、兔抗天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)抗體購自美國Abcam公司，針對LINC00308的小干擾RNA(LINC00308 siRNA，si-LINC00308)、小干擾RNA陰性對照si-NC、miR-634 mimic、陰性對照miR-NC購自上海GenePharma公司，磷脂酰結合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京KeyGen公司，細胞周期分析試劑盒購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染 將PC-3M和DU145細胞在含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，并保持在37℃、5% CO2的潮濕氣氛中生長。轉染前一天在24孔板中接種PC-3M和DU145細胞(1×105個細胞/孔)。根據制造商的說明，使用Lipofectamine 2000將si-LINC00308或si-NC(100 nM)、miR-634 mimic、miR-NC轉染到細胞中。轉染后4 h，用完全RPMI 1640培養基代替轉染培養基，再培養48 h。轉染后，在4℃下12 000×g離心15 min后收集細胞，并通過qRT-PCR檢測干擾或過表達效率。

1.2.2 qRT-PCR 為了檢測LINC00308、miR-634表達，使用Trizol試劑從前列腺癌組織或轉染后的PC-3M和DU145細胞中提取總RNA。根據制造商的規程，使用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。然后使用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒進行qRT-PCR。所用引物如下：LINC00308 5′-CAGATAAGACTCTGTCTACCCT-3′(正向)和5′-ACTGAATAAAGGAATGATGCGT-3′(反向)；GAPDH 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′(正向)和5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′(反向)；miR-634 5′-CAGTCTCAAACCAGCACC-3′(正向)和5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′(反向)；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)。其中GAPDH、U6用作內源性對照。所有樣品均在ABI 7900實時PCR系統運行。使用2-ΔΔCt公式進行LINC00308、miR-634相對表達水平的計算。

1.2.3 細胞增殖分析 以細胞周期反映細胞的增殖能力。收集轉染后的PC-3M和DU145細胞，在4℃的70%冷乙醇中固定4 h。用冷磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗滌細胞兩次，并在37℃黑暗中用含有100 mg/mL PI和20 mg/mL RNase A的溶液染色30 min。使用BD FACSCalibur流式細胞儀進行分析，并使用FlowJ軟件對細胞周期分布進行定量。

1.2.4 細胞凋亡評估 根據制造商的說明，使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀檢測PC-3M和DU145細胞凋亡。收集轉染后的PC-3M和DU145細胞，用PBS洗滌兩次，然后懸浮于500 μL含有Annexin V-FITC(5 μL)和PI染色溶液中。在黑暗中孵育30 min后，通過流式細胞儀分析細胞。早期細胞凋亡由Annexin V+/PI-定義，晚期細胞凋亡由Annexin V+/PI+染色定義，細胞凋亡率為早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞之和。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 starBase網站預測LINC00308的潛在靶標，發現LINC00308與miR-634部分堿基可形成互補配對。分別合成包含二者結合位點的野生型(WT)或突變型(MUT)LINC00308序列，并將其克隆到pmirGLO熒光素酶載體中，以生成WT-LINC00308或MUT-LINC00308。轉染前24 h，將PC-3M細胞以每孔5×103個細胞的密度接種到24孔板中。使用Lipofectamine 2000將PC-3M細胞與miR-634 mimic或miR-NC和WT-LINC00308或MUT-LINC00308共轉染。48 h后，用雙重熒光素酶報告基因測定系統測定熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western Blot) 對于Ki67、Caspase3蛋白水平檢測，使用RIPA緩沖液分離轉染后的PC-3M和DU145細胞的總蛋白，并使用雙辛可寧酸蛋白測定試劑盒進行定量。通過SDS-PAGE分離20 μg蛋白質裂解物，并轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，與所需的一抗在4℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶(HRP)結合的二抗在室溫下以1∶5000的稀釋度孵育1 h。洗滌后，用ECL試劑可視化目標蛋白條帶，使用Quantity One軟件通過光密度測定法定量蛋白水平。其中，Ki67、Caspase3和參照蛋白GAPDH的抗體均為1：1000稀釋。

2 結果

2.1 LINC00308在前列腺癌中的表達 qRT-PCR檢測33例前列腺癌標本中LINC00308的表達情況，見表1，數據顯示，LINC00308在前列腺癌組織中的表達水平遠遠高于癌旁組織(P<0.05)。

表1 LINC00308在前列腺癌中的表達

2.2 干擾LINC00308對PC-3M和DU145增殖凋亡的影響 qRT-PCR檢測LINC00308、miR-634的表達(表2、表3)，發現與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯降低PC-3M和DU145細胞中LINC00308的表達水平，顯著提高miR-634的表達水平(P<0.05)。對細胞周期檢測結果顯示(表2、表3)，與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯增加PC-3M和DU145細胞的G0-G1期細胞比例，顯著減少S期細胞比例(P<0.05)，而G2-M期細胞比例無明顯變化(P>0.05)。對細胞凋亡的測定結果表明(圖1、表2、表3)，干擾LINC00308后，PC-3M和DU145細胞的凋亡率明顯高于si-NC組(P<0.05)。

表2 干擾LINC00308對PC-3M增殖凋亡的影響

表3 干擾LINC00308對DU145增殖凋亡的影響

圖1 干擾LINC00308對PC-3M和DU145凋亡的影響

2.3 LINC00308靶向miR-634 生物信息學軟件對LINC00308與miR-634的結合進行預測(圖2)，結果顯示，二者存在靶向結合位點。雙熒光素酶報告實驗的分析結果表明(表4)，與miR-NC組相比，miR-634組轉染WT-LINC00308的PC-3M細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，轉染MUT-LINC00308的細胞熒光素酶活性變化不顯著(P>0.05)。

圖2 LINC00308靶向miR-634

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.4 miR-634對PC-3M和DU145增殖凋亡的影響 qRT-PCR檢測轉染后miR-634 mimic的表達，發現與miR-NC組相比，轉染miR-634 mimic明顯提高PC-3M和DU145細胞中miR-634的表達水平(P<0.05)。對細胞周期檢測結果顯示，與miR-NC組相比，轉染miR-634 mimic明顯增加PC-3M和DU145細胞的G0-G1期細胞比例，顯著減少S期細胞比例(P<0.05)，而G2-M期細胞比例無顯著變化(P>0.05)。對細胞凋亡的分析結果表明，轉染miR-634 mimic后，PC-3M和DU145細胞的凋亡率明顯高于miR-NC組(P<0.05)，見圖3、表5、表6。

圖3 miR-634對PC-3M和DU145凋亡的影響

表5 miR-634對PC-3M增殖凋亡的影響

表6 miR-634對DU145增殖凋亡的影響

2.5 Western Blot檢測Ki67、Caspase3蛋白的表達 Western Blot檢測Ki67、Caspase3蛋白的表達(圖4、表7)，結果顯示，與si-NC組相比，干擾LINC00308明顯降低PC-3M和DU145細胞的Ki67蛋白水平，和顯著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)；與miR-NC組相比，轉染miR-634 mimic明顯降低PC-3M和DU145細胞的Ki67蛋白水平，并顯著提高Caspase3蛋白水平(P<0.05)。

圖4 PC-3M和DU145中Ki67、Caspase3蛋白的表達

表7 Ki67、Caspase3蛋白的表達

3 討論

前列腺癌是男性的主要健康問題，目前盡管早期診斷和治療策略的發展取得了許多進展，但前列腺癌仍然是一種致死性疾病[11-12]。因此，迫切需要探索導致前列腺癌發生的調控機制，這將有助于確定新的治療靶點和開發有效的治療方法[13]。這項研究的數據表明，LINC00308在前列腺癌中表達上調，干擾其表達可以抑制前列腺癌細胞的進展，其作用機制與靶向miR-634有關。

lncRNA代表一類新型的非編碼RNA，其長度超過200個核苷酸，并且不具有蛋白質編碼潛[14]。最近，發現lncRNA在癌癥中失調和參與各種癌癥的生物過程，如增殖，細胞凋亡，遷移和侵襲[15-16]。在以前的研究中，LINC00308被發現參與了前列腺癌的發生和發展，LINC00308在前列腺癌患者中表達上調[17]。但LINC00308對前列腺癌發展的功能作用尚需進一步研究。在本項研究中，觀察到了與之前報道[7,17]相同的結果，LINC00308在33例前列腺癌組織中異常增加，這表明了LINC00308作為該疾病的致癌lncRNA的可能作用。為了確定LINC00308的詳細功能，本實驗利用小干擾RNA技術在前列腺癌細胞中干擾LINC00308的表達，發現轉染si-LINC00308后，PC-3M和DU145細胞中LINC00308的表達水平被下調，說明成功構建干擾LINC00308表達的細胞。隨后本實驗對細胞的增殖、凋亡變化進行檢測，結果顯示，干擾LINC00308顯著提高PC-3M和DU145細胞的G0-G1期細胞比例，降低S期細胞比例和增殖相關蛋白Ki67的表達，并且增加了細胞凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase3表達水平，這表明干擾LINC00308的表達通過阻滯前列腺癌的細胞周期于G0-G1期來抑制癌細胞增殖，并促進細胞的凋亡，這意味著干擾LINC00308可以抑制前列腺癌的發展。

值得注意的是，miR-634已被鑒定為人類癌癥中的腫瘤抑制因子[18]。胰腺癌組織和細胞系中的miR-634表達水平顯著下調，miR-634在胰腺癌細胞中的異位過表達抑制了腫瘤的進展[19]。與正常腦組織相比，miR-634在神經膠質瘤組織中被下調，并且其表達與腫瘤大小和WHO分級相關[20]。miR-634通過靶向信號轉導與轉錄因子3(Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)降低人乳腺癌細胞的放射抵抗力[21]。本實驗利用脂質體用miR-634 mimic轉染前列腺癌PC-3M和DU145細胞，結果表明，轉染后miR-634 mimic的表達水平被上調，提示轉染有效。繼續探索miR-634在前列腺癌發生發展中的意義，結果發現miR-634的過表達可以增加PC-3M和DU145細胞的G0-G1期細胞比例、凋亡率和Caspase3蛋白水平，明顯減少S期細胞比例和Ki67蛋白水平，這說明miR-634能夠促進前列腺癌細胞G0-G1期阻滯，及誘導其凋亡，顯示出一定的抗前列腺癌功能。

新興證據表明，lncRNA通過海綿狀miRNA充當競爭性內源RNA(ceRNA)[22-23]。例如lncRNA DANCR作為競爭性內源性RNA，通過在膠質瘤中海綿化miR-634來調節膠質瘤進展[24]。本研究通過生物信息學工具預測了與LINC00308具有互補堿基配對的miRNA，篩選出潛在的靶基因miR-634。在細胞功能測定中，檢測到干擾LINC00308可以提高前列腺癌細胞內miR-634的表達水平。并且，雙熒光素酶報告實驗進一步證實了LINC00308對miR-634的靶向調控，這些結果說明miR-634是LINC00308的功能性靶基因，結合前述結果，提示干擾LINC00308抗前列腺癌的功能是通過上調miR-634的表達來實現的。

4 結論與啟示

本研究顯示，前列腺癌患者中LINC00308異常升高，而干擾LINC00308的表達抑制了前列腺癌細胞的增殖，并誘導了細胞的凋亡。另外，miR-634是介導上述LINC00308功能的相關miRNA，即干擾LINC00308通過促進miR-634的表達影響前列腺癌細胞增殖與凋亡。這一結果提示LINC00308可作為前列腺癌的潛在預后標志物和治療靶標。