大鼠腎臟5/6切除microRNA-483-3p的表達變化及機制*

尚粉青 顧文娟 郭瑄 王蘭 韓媛 寧明安

(西北大學附屬第一醫院·西安市第一醫院心血管內科，陜西 西安 710002)

慢性腎衰竭是各種腎病持續發展的最終結局，嚴重危害人類健康。而慢性腎病發展過程中最重要的病理改變為腎臟纖維化，有效延緩或逆轉腎纖維化進程可延緩慢性腎病進展。目前發現有多種microRNA參與腎臟疾病的發生及發展。研究證實，慢性腎病發展過程中microRNA-92a(miR-92a)升高[1]，阿托伐他汀可以降低miR-92a的表達,延緩慢性腎病進展[2]。miR-483-3p既往在多種腫瘤發病過程中有系列研究[3-5]，近年研究結果提示miR-483-3p對肝細胞纖維化[6]、肺動脈高壓[7]具有顯著抑制作用，對結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)]8]、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF-β)及EGFR/PTEN(epidermal growth factor receptor/Phosphatase and tensin homolog)信號通路[9]、DPC4/Smad4及AANAT(arylalkylamine N-acetyltransferase)[10]等纖維化相關因子均有調節作用。本研究主要探討在慢性腎病發病過程中miR-483-3p的表達變化及其作用機制，并進一步研究過表達miR-483-3p是否可延緩慢性腎病發展。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 miR-483-3p Agomir購自廣州市銳博生物科技有限公司。主要試劑：PCR引物(miR-483-3p、CTGF、PTEN等)：生工(上海)有限公司合成。β-actin抗體購自Santa Cruz公司；CTGF抗體、PTEN抗體購自美國Cell Signaling公司。Trizol 試劑(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR SuperMix逆轉錄試劑盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余試劑為國產分析純。主要儀器：實時定量PCR儀及梯度PCR儀(美國Applied Biosystems 公司)，WB電泳儀和電泳槽、WB半干轉膜槽(BIO-RAD公司)，自動洗片機(柯達公司)。

1.2 大鼠5/6腎切除慢性腎衰模型[11]的建立 選用36只8～10周齡雄性SD大鼠作為研究對象，購自西安交通大學實驗動物中心，清潔級別：SPF級；所有實驗操作均得到西安市第一醫院實驗動物倫理委員會審批批準。所有大鼠均在室溫24℃，12小時光照，12小時黑暗，充足水供和飼料。隨機分為2組：A組:假手術組(12只)；B組：5/6腎切除(24只)。二步法建立5/6腎切除模型，以20%的烏拉坦(0.6mL/100g)腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術臺上，局部剪毛，右側腹直肌外緣常規消毒，無菌操作下垂直切口開腹，長約3cm，暴露右腎，分離固定，按上極、下極弧形切右腎組織，主要切皮質，用噴有凝血酶的凝膠海綿壓迫止血，待血止后縫合包扎，切除的右腎組織只是約占一側腎臟皮質的2/3。術后24小時手術組死亡2只。術后2周再次手術，同樣方案麻醉，切開左側腹部皮膚，暴露左腎，結扎腎蒂，切除左腎。假手術組制備方法：同樣方法麻醉及開腹，不切除腎臟，分離腎周膜，保留腎上腺即關腹。

1.3 動物分組及處理 36只SD大鼠適應環境1周，手術造模，隨機分成對照組(假手術組，12只)及模型組(5/6腎切除組，24只)。24只隨機分成2組：模型組(5/6腎切除組，12只)；miR-483-3p過表達組(5/6腎切除+miR-483-3p Agomir，12只)。miR-483-3p Agomir給予60mg/kg尾靜脈注射，每2周1次。對照組和模型組每2周給予等量的生理鹽水尾靜脈注射。大鼠自由進食、飲水。術后8周處死動物，留取標本。

1.4 標本的采集 處死大鼠前一天，將大鼠置金屬代謝籠,留取24小時尿液。處死大鼠當天用10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹腔正中切口，經腹主動脈采血，提取血清，測定血生化。分別稱重3組腎臟質量，剩余的大部分組織分成1cm3大小置-80℃冰箱保存，用于分子生物學研究。

1.5 血清各項指標的測定 采用血自動生化儀測定血尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及高敏C反應蛋白。測定24小時尿蛋白定量。

1.6 腎臟組織各項指標的測定 取腎臟組織50mg，剪碎，加入Trizol 1mL超聲勻漿，提取腎臟組織RNA，RT-PCR方法測定腎臟組織中miR-483-3p、CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的含量。PCR引物序列(見表1)。取腎臟組織80mg/只，剪碎組織，加入蛋白裂解液約300mL，勻漿機勻漿，3次，每次30s；液氮凍融3次，4℃，12000r/min，離心15min，取上清，ABC法測定蛋白濃度。Western Blot方法測定腎臟組織中蛋白表達的變化。

表1 實時定量PCR引物列表

2 結果

2.1 血清中一般生化指標及24小時尿蛋白定量 與正常對照組相比，模型組尿素氮(BUN)(t=21.13，P<0.05)和肌酐(Cr)(t=14.38，P<0.05)明顯升高，血漿總膽固醇(TC)(t=8.136，P<0.05)及低密度脂蛋白(LDL-C)(t=5.404，P<0.05)亦顯著升高。miR-483-3p Agomir干預組與模型組比較，尿素氮(t=4.105，P=0.0011)和肌酐(t=4.207，P=0.0009)明顯降低，兩組比較差異有統計學意義。但血脂水平在治療前后無明顯變化(TC：t=0.6759，P=0.5101；LDL-C：t=1.476，P=0.1620)。炎癥指標hs-CRP(t=4.775，P=0.0003)及24小時尿蛋白定量(t=26.04，P<0.05)在模型組明顯升高，miR-483-3p Agomir干預組較模型組顯著降低(hs-CRP：t=2.435，P=0.0294；24h Urine protein：t=4.863，P=0.0003)，見表2。

表2 三組血清生化指標的比較

2.2 腎臟組織中miR-483-3p下游靶基因變化預測 RT-PCR檢測預測miR-483-3p的下游靶基因CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的含量變化，結果顯示與對照組相比，模型組腎臟組織中CTGF(t=4.313，P=0.00028)和EGFR/PTEN(t=3.590，P=0.00163)表達顯著升高，而TGF-β(t=1.559，P=0.133368)、DPC4/Smad4(t=0.2071，P=0.83780)及AANAT(t=0.4071，P<0.68783)無明顯變化，見圖1。提示在大鼠5/6腎切除導致的腎功能不全病理進展過程中CTGF和EGFR/PTEN起重要作用。

圖1 腎臟miR-483-3p下游靶基因表達變化預測

2.3 三組大鼠腎臟miR-483-3p及CTGF、PTEN表達變化情況 與對照組相比，模型組腎臟組織中miR-483-3p的表達明顯升高(t=7.335，P<0.05)，miR-483-3p Agomir干預組腎臟組織miR-483-3p的表達升高更顯著(t=11.35，P<0.05)；模型組腎臟組織中CTGF(t=5.667，P<0.05)和EGFR/PTEN(t=3.393，P=0.00261)表達顯著升高，miR-483-3p Agomir干預組較模型組表達顯著降低，見圖2。

圖2 三組大鼠腎臟miR-483-3p及下游靶基因表達變化

2.4 miR-483-3p上游宿主基因IGF-2的表達變化 與對照組相比，模型組腎臟組織中IGF-2的表達明顯升高(t=3.905，P=0.0008)，miR-483-3p Agomir干預組腎臟組織IGF-2的表達較模型組表達顯著降低(t=3.101，P=0.0056)，見圖3。

圖3 三組大鼠腎臟IGF-2表達變化

3 討論

隨著microRNA在慢性腎病中的研究日益深入,已發現有多種microRNA參與腎臟疾病的發生及發展[12-14]。我們前期研究發現miR-92a在腎功能損傷的進展過程中起重要作用，而阿托伐他汀等藥物通過降低miR-92a表達可有效緩解腎臟損傷。近來有研究顯示，miR-483有明確的抗纖維化作用，對多條纖維化信號通路均有抑制作用[8-10]。miR-483-3p是由胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor 2，IGF-2)第二內含子上的一段區域轉錄剪切形成的，最早被發現在人類肝臟中，除此之外還存在于皮膚、腎臟、脂肪等多種組織器官中[15]。目前已有許多研究圍繞miR-483展開。已被發現的miR-483的靶基因包括EGFR/PTEN/AKT信號通路，DPC4/Smad4(3p)，ERK1(5p)，AANAT，CTGF。這些分子在細胞的生長、增殖及遷移過程中均有重要的作用。因此，miR-483存在著廣泛的生理與病理學意義。除此之外，多種腫瘤細胞研究亦證明miR-483有抑制腫瘤細胞增殖遷移的作用[16-19]。miR-483過表達的小鼠還有一定抗肝纖維化的表現[6]。

本研究我們證實了5/6腎切除模型慢性腎纖維化大鼠的造模成功，血BUN、Cr及24小時尿蛋白定量均顯著增加。miR-483-3p Agomir干預組血BUN、Cr及24小時尿蛋白定量較模型組顯著降低，證實了過表達miR-483-3p對腎臟纖維化的治療作用。我們進一步探討miR-483-3p對腎臟的保護作用是通過作用于哪些靶基因，檢測了CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的表達，結果顯示CTGF和PTEN表達顯著升高，而TGF-β、DPC4/Smad4及AANAT無明顯變化。大量研究已證實CTGF[20]及PTEN[21-22]在慢性腎纖維化過程中的重要作用。本研究進一步證實miR-483-3p Agomir干預組CTGF和PTEN表達較模型組顯著降低。同時，對于miR-483-3p的宿主基因IGF-2的表達情況，研究結果顯示模型組IGF-2顯著增加，而miR-483-3p Agomir干預組較模型組有降低趨勢。

我們認為在腎臟疾病發展初期，隨著IGF-2表達，增加內皮細胞miR-483-3p表達，抑制其靶基因CTGF、PTEN等表達，減少細胞外基質膠原蛋白、黏連蛋白等表達，以延緩腎臟纖維化的發展；同時miR-483-3p反饋抑制IGF-2/miR-483表達[8]，從而使miR-483的表達不能顯著增加來拮抗腎臟纖維化的病理發展；而隨著腎臟損傷加重，miR-483-3p表達下降，使其無法發揮腎臟保護作用，腎纖維化進一步加重。通過尾靜脈注射外源性補充富含miR-483-3p的外泌體，使其腎臟組織有足夠的miR-483-3p來有效延緩腎臟纖維化進展。

本研究結果提示在5/6腎切除模型大鼠腎臟中過表達miR-483-3p作用于其靶基因CTGF/PTEN來延緩腎臟病的發展。此方面的探討為我們進一步研究microRNA與腎臟疾病關系提供了理論依據。但本研究局限之處在于沒有對miR-483-3p下游的靶基因進行系統的篩查從而得到更完善的作用機制，今后我們將繼續這方面研究。

4 結論

在慢性腎臟疾病發展過程中，隨著IGF-2表達增加，miR-483-3p表達亦增加。miR-483-3p可反饋抑制其宿主基因IGF-2的表達，同時通過抑制其靶基因CTGF、PTEN的表達，可延緩腎臟纖維化過程。