盧迪 李苗苗 郝建宇

首都醫科大學附屬北京朝陽醫院消化內科，北京 100020

大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels，BKCa)是鉀離子通道中的一員，在機體內廣泛分布，已被證實參與許多重要的生物學活動，如動作電位復極化、神經元興奮性傳導、神經遞質的釋放、激素的分泌、維持平滑肌組織的張力等[1]。BKCa與高血壓、心力衰竭、糖尿病等多種疾病相關[2-4]，但其在胰腺相關疾病中的研究較少，目前僅有少量研究報道BKCa對胰腺導管腺癌、胰腺神經內分泌腫瘤的發生發展有一定影響，但并未深入探討相關的分子機制[5-6]。轉錄組測序是一種高通量測序技術，以基因功能和結構研究為基礎和出發點，準確獲得某一物種特定細胞、組織或器官在特定狀態下所有轉錄本序列信息，用于研究差異基因表達、基因功能和結構、新轉錄本預測以及預測相關蛋白質相互作用等，具有通量高、可重復性高、檢測范圍寬、定量準等優勢，現已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。本研究通過轉錄組測序分析BKCa基因敲除大鼠胰腺的基因表達及信號轉導通路變化，以期為胰腺疾病BKCa的研究提供理論依據。

材料與方法

3只BKCa基因敲除成年雌性SD大鼠由首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系王偉教授饋贈。該模型由南京大學模型動物研究中心采用CRISPR/Cas9法制備，通過雜合的雌雄繁殖對維持傳代。3只野生型成年雌性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，作為野生組。動物飼養條件：溫度(22±2)℃，濕度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗循環，自由接觸飼料和水。

大鼠取胰腺前12 h禁食，自由飲水。采用戊巴比妥溶液4 mg/100 g行腹腔內麻醉，備皮、消毒后取腹正中線切口入腹，從肝右葉下后方提出十二指腸，可見十二指腸包繞的呈片狀粉紅色的胰腺組織，將胰腺組織全部提出，浸泡入RNA later溶液中備用。

用Trizol(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA，用Agilent 2100 BioAnalyzer分析儀(Agilent Technologies公司)和Qubit Fluorometer熒光儀(Invitrogen公司)評估RNA完整性(RNA integrity number, RIN)，即RIN>7.0且28S/18S>1.8。所有樣本均建立一個獨立的cDNA文庫進行單獨測序。應用美國Illumina生物技術公司的樣品制備試劑盒構建cDNA文庫，按說明書操作。隨后使用Agilent 2000儀(Agilent Technologies公司)進行庫檢，庫檢合格后利用HiSeq2500高通量測序平臺(Illumina公司)對文庫進行測序，并使用Fast QC(Version 0.11.5)軟件對測序質量進行評估，然后使用NGSQC(v0.4)軟件過濾，去除接頭、剪切末端低質量堿基等。最后使用HISAT2軟件對過濾后的數據與野生型SD大鼠的參考基因組進行比對。

利用差異基因分析軟件DEGseq2進行統計，以P≤0.05且|log2fold change|≥1.0為標準，篩選出差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，并對具有相同或相似表達行為的DEGs做層次聚類分析。

通過檢索Ensembl數據庫、美國國家生物技術信息中心數據庫(National Center for Biotechnology Information, NCBI)、通用蛋白質數據庫(UniProt Knowledge base, Uniprot)、基因本體數據庫(gene ontology, GO)、京都基因與基因組百科全書數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件比對，確定DEGs的功能注釋。選取最佳匹配項來標注DEGs。最后使用Go seq R包和KOBAS 3.0軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)對檢測到的DEGs進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。P值或q值<0.05認為是顯著富集。

使用SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒(美國Life公司)將BKCa敲除組大鼠和野生組大鼠胰腺組織總RNA逆轉錄后得到cDNA，隨后使用SYBR Green試劑盒(美國Life公司)進行實時熒光定量PCR反應，以β-actin為內參照。因為PI3K/Akt信號通路在胰腺的生理及疾病狀態下的功能十分重要，故驗證該通路內的DEGs。PI3K/Akt信號通路中關鍵基因的引物序列見表1[7-11]。反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個循環。用公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

結 果

提取的總RNA 的A260/280值均在1.8～2.1之間，濃度均在500 mg/L以上。各樣本Clean Data中Q30堿基百分比均≥90%，將Clean Data與參考基因組進行序列比對，各樣本的reads與參考基因組的比對率均≥ 70%，樣本質量合格。

BKCa敲除組和野生組大鼠胰腺樣本共檢測到18 258個基因，這些基因在NCBI、Uniprot、KEGG、GO、Ensembl中的注釋數量分別為15 872、15 576、5754、10 495、18 258個。通過GO數據庫分析表明這些基因富集在4 870個GO條目內，其中3 734個涉及生物學過程，471個涉及細胞組分，665個涉及分子功能；通過KEGG數據庫分析表明這些基因富集在細胞進程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、機體系統等生物學過程中。

經DESeq2軟件篩選出348個DEGs，其中200個在BKCa敲除組中高表達，148個低表達(圖1)。聚類分析后發現BKCa敲除組和野生組之間DEGs的區分明顯(圖2)。

圖1 差異表達基因火山圖

圖2 BKCa敲除組(1)和野生組(2)差異表達基因聚類熱圖

348個DEGs中， GO數據庫顯示214個富集在56個GO條目內，其中24個涉及生物學過程，18個涉及細胞組分，14個涉及分子功能(圖3)。

圖3 差異表達基因在GO數據庫中的注釋情況

KEGG數據庫顯示348個DEGs在細胞信號通路等條目中有較多的注釋(圖4)，富集前3位的通路分別為感覺系統相關通路、蛋白消化吸收相關通路和PI3K/Akt信號通路(圖5)。

圖4 差異表達基因在KEGG數據庫中的注釋情況

圖5 差異表達基因的KEGG富集分析

對富集到PI3K/Akt的15個DEGs進行統計，結果顯示表達上調的基因包括Lama2、Rxra、Itga3、Cdkn1a、Hsp90ab1、Hsp90aa1、Il6r、Foxo3a、Thbs1、Kit、Col4a1、Lamc1、Col1a2；表達下調的基因包括Ppp、Pik3r1。

RT-PCR對表達上調的前5位基因(Hsp90ab1、Hsp90aa1、Foxo3a、Thbs1、Col1a2)和表達下調的2種基因(Ppp、Pik3r1)進行驗證，結果顯示BKCa敲除組胰腺Hsp90ab1、Hsp90aa1、Foxo3a、Col1a2基因的表達顯著高于野生組，而Thbs1、Pik3r1和Ppp基因表達差異無統計學意義(表2)。

表2 胰腺組織PI3K/Akt信號通路中關鍵基因的mRNA表達

討 論

BKCa在胰腺中的功能尚不十分清楚，本研究通過轉錄組測序對BKCa基因敲除大鼠及野生型大鼠的胰腺進行基因表達分析，隨后通過基因富集分析發現BKCa可能與多條重要的信號轉導通路如PI3K/Akt信號通路、Estrogen信號通路、TGF-β信號通路、GnRH信號通路等存在密切的關系。

本研究富集到PI3K/Akt信號通路的差異基因數量最多，達15個。對其中7個基因進行RT-PCR驗證，發現4個差異基因表達情況與測序結果相符，這可能是由于二代測序和RT-PCR兩種方法的靈敏度和特異度的差異所導致，通常以RT-PCR等實驗驗證的結果為準。

本研究結果顯示，BKCa敲除后Foxo3a表達上調十分顯著，而Pik3r1表達無明顯變化(Pik3r1是編輯PI3K重要亞基的基因)。既往文獻提示Foxo3a在胰腺癌中主要發揮抑癌作用[12]，也有研究指出Foxo3a可能在肝癌[13]、胃癌[14]、結直腸癌[15]等消化系統惡性腫瘤中發揮抑癌基因的作用。而Foxo3a最常受到PI3K/Akt信號傳導通路的調控，活化的PI3K/Akt會通過一系列信號轉導導致Foxo3a在細胞內定位的改變或降解，從而促進癌癥的進展[16]。本研究結果提示，BKCa可能在PI3K/Akt的下游抑制Foxo3a的表達，進而發揮促癌作用，這一假說與BKCa在胰腺神經內分泌腫瘤中的研究結果相吻合[5]。但BKCa影響Foxo3a表達的具體機制尚需進一步研究。

除Foxo3a外，Hsp90相關基因在BKCa敲除大鼠胰腺中也被證實為表達顯著上調。而Hsp90通常被認為會促進癌癥進展，且已被證實與胰腺癌的發生和發展密切相關[17]。本研究中BKCa基因敲除后Hsp90表達上調，提示BKCa可能對Hsp90的表達起抑制作用，從而推測BKCa可能發揮抑癌作用，與前述文獻得出的結論相反，這可能是由于本研究的局限性所導致的，因為轉錄組測序僅僅是針對基因表達量的分析，部分基因及其轉錄、翻譯的蛋白發揮生物學功能時可能并不依賴表達量，而是依賴磷酸化、甲基化等方式。本課題組下一步擬從利用BKCa抑制劑、激動劑以及膜片鉗等技術全面分析BKCa在胰腺細胞中的作用，以期為今后的臨床和基礎研究提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突