不同消毒劑對蘋果幼葉愈傷組織形成的影響

鄧金祥，楊光柱，馬 鈞，鄭麗萍，李 帆，黃文靜*

（1.會澤縣紙廠鄉農業技術推廣站，云南會澤654200；2.云南省農業科學院園藝作物研究所，云南昆明650205）

植物組織培養技術是20世紀30年代初期利用植物細胞全能性發展起來的一項生物技術，到目前為止，該技術已經在植物生理學、植物病理學、作物遺傳育種、生物化學、植物脫毒苗培育、無性系快速繁殖、種質資源低溫保存以及加快育種進程等各個研究領域發揮著重要的基礎作用，為珍稀瀕危植物的優良品種快速繁育、脫病毒、突變篩選、次生代謝產物的工廠化生產、種質資源庫建設和基因庫建立等方面開辟了新途徑，已經成為現代生物技術中重要的基礎技術和研究手段之一[1-3]。但植物組培期間污染問題一直是國內外研究和探討的主要問題之一。

目前植物組織培養過程中常用的消毒劑主要有漂白粉、過氧化氫、酒精、新潔爾滅、次氯酸鈉、升汞、吐溫，但這些消毒劑都具有對植物外植體的毒副作用，對環境也具有一定危害。本試驗采用不同消毒劑，在消毒時間、培養條件相同的情況下，研究不同消毒劑對蘋果幼嫩葉片的消毒效果的影響，進而誘導蘋果幼嫩葉片獲得高質量愈傷組織，為進一步開展育種研究、建立快繁體系等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自云南省昆明市云南省農業科學院園藝作物研究所實驗基地。選取秋季生長旺盛、健壯、無病蟲害的紅富士幼嫩葉片作為外植體進行消毒效果比較實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理

將幼嫩葉片用洗潔精清洗干凈，流水沖洗5 min。

1.2.2 不同消毒劑及消毒濃度

配 制75%酒 精、10% NaClO2、吐 溫-80、0.1%HgCl2、50 mg·L-1納米銀植物外植體消毒劑備用。

1.2.3 不同消毒劑的處理

在超凈工作臺上，葉片統一用75%酒精消毒30 s，無菌水清洗3遍。試驗設置3個處理：處理1，10% NaClO2+1滴吐溫-80處理8 min；處理2，0.1%HgCl2處理8 min；處理3，50 mg·L-1納米銀組培專用消毒劑（重慶新位點生物科技有限公司）暗處理8 min[4]。滅菌時手工搖晃，以達到更好的滅菌效果。處理后，無菌水清洗4～5次，第1次清洗1 min。

1.3 培養條件

處理后的葉片用無菌紙吸干多余水分，切割成1 cm2左右小塊，接種于MS+2，4-D 2.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+維生素C 2 g·L-1葉片誘導愈傷組織培養基中，每瓶放置10片，每組10瓶，3次重復，放置于25℃，光照1000～1200 Lx，光照4 h·d-1。

從培養第2 d起，每隔5 d調查1次，總共調查8次。

1.4 統計與分析

采用Excel 2017統計污染率、褐化率、存活率、并按照下式計算：

污染率（%）=（污染數/接種總數）×100褐化率（%）=（褐化數/接種總數）×100

存活率（%）=[（接種總數-污染數-褐化數）/接種總數]×100

2 結果與分析

由表1可知，處理1從葉片培養的第12 d開始，污染率基本保持不變，褐化率、存活率在第22 d開始基本保持穩定，葉片開始膨大，形成愈傷組織小細胞團。處理2污染率在第7 d達到12.5%，后續保持不變，但褐化率持續增高，存活率持續降低，最終只達到11.9%。處理3在葉片培養的第12 d，污染率、褐化率、存活率基本保持穩定，葉片邊緣沒有出現愈傷組織小細胞團。

由表2可知，處理2消毒效果最好，但對幼葉傷害最嚴重，存活率最低，僅為11.9%；培養第37 d，存活的葉片膨大，周邊出現愈傷組織小細胞團。處理3消毒效果不理想，污染率為32.5%，褐化率中等，存活率中等，為22.3%；培養第37 d，葉片無膨大，沒有出現愈傷組織小細胞團。處理1污染率中等，對幼葉傷害最小，褐化率為20.5%，存活率最高達50.7%；培養第37 d，葉片膨大，出現愈傷組織小細胞團。綜合考慮，污染率、褐化率、存活率、有無愈傷組織細胞團形成，本實驗最適宜的消毒處理方法為10% NaClO2+1滴吐溫-80消毒8 min。

表1 不同消毒劑處理葉片生長情況

表2 不用消毒劑對蘋果嫩葉消毒效果

3 討論與結論

木本植物組織培養中較困難的是獲得無菌材料[4]，外植體消毒是否成功，不但關系到能否獲得無菌材料，也是蘋果組培快繁體系建立的關鍵之一。研究表明，不同消毒劑對外植體消毒效果不同，考慮到消毒劑對植物外植體的毒害程度、對環境的影響程度，本實驗采用了已在生物醫學方面應用廣泛的納米銀消毒劑進行植物外植體消毒，與常用的10% NaClO2+1滴吐溫-80和0.1% HgCl2進行對比，在消毒時間、培養條件相同的情況下，對比了3種消毒劑的消毒效果及愈傷組織誘導情況，發現0.1% HgCl2消毒效果最好，對葉片損害最小。愈傷組織誘導效果最好的是10% NaClO2+1滴吐溫-80。50 mg·L-1納米銀消毒效果居中，且價格較高，消毒需要在暗環境下進行操作，且存活的葉片并未誘導出愈傷組織。所以，10%NaClO2+1滴吐溫-80消毒仍然是蘋果葉片誘導愈傷組織較理想的消毒劑。