桔梗皂苷D通過抑制AT1-CARP通路改善AMI大鼠心肌細胞凋亡和心臟功能的研究*

孟慶雯，劉華江，黃 珊，楊珊珊，楊 洋

(海南醫學院第一附屬醫院心血管內科，海口 570100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范圍內常見的心血管疾病，亦是導致心源性猝死的主要原因，AMI發病率及病死率高，且總體呈上升趨勢[1]，對于治療AMI新型藥物的研究一直是研究的重點。桔梗皂苷D是桔梗的主要化學成分，具有抗炎、降血脂、抗腫瘤等藥理作用[2]。已有研究表明，桔梗皂苷D對乳腺癌等有治療作用[3-4]，但其對AMI的作用尚未有明確研究，本文探討了桔梗皂苷D對AMI的影響及機制，旨在為AMI的臨床治療提供幫助，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

桔梗皂苷D(上海展舒化學科技有限公司，純度大于98%)；戊巴比妥(江蘇艾康生物醫藥研發有限公司)；TUNEL細胞凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；ELISA檢測試劑盒(天津安諾瑞康生物技術有限公司)；血管緊張素1(AT1)、心錨重復蛋白(CARP)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗、山羊抗體二抗(沈陽萬類生物技術有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠AMI造模

結扎冠狀動脈前降支構建大鼠AMI模型，具體步驟為：腹腔注射50 mg/kg劑量的戊巴比妥溶液麻醉SD大鼠，同時使用面罩通氣支持呼吸，于左側第3或4肋間隙開胸暴露心臟，打開心包，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，通過心電圖ST-T 改變檢測心肌梗死。假手術組只穿線不結扎，術畢后逐層縫合關胸。

1.2.2動物給藥及分組

假手術組大鼠作為對照，造模成功的AMI大鼠分為AMI組、桔梗皂苷D低、中、高劑量組，其中桔梗皂苷D低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg/kg的給藥劑量灌胃給藥，每天1次，給藥4周；假手術組和AMI組給予相同體積和頻次的生理鹽水。

1.2.3心臟功能檢測

各組大鼠給藥結束后腹腔注射戊巴比妥麻醉，使用超聲顯像儀行超聲心動圖檢查，分別檢測左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室短軸縮短率(LVFS)和左心室射血分數(LVEF)，比較各組大鼠上述指標。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色

實驗結束后解剖獲取各組大鼠心肌梗死區域組織，于組織固定液中固定24 h，清洗后經70%、80%、90%、95%的乙醇及無水乙醇梯度水化，再浸入二甲苯溶液中2次，分別于硬石蠟和軟石蠟中浸泡30 min，并于石蠟液中冷卻凝固。于切片機上制備組織切片，然后將切片置于二甲苯中脫蠟，依次經100%、95%、90%、80%、75%的乙醇水化后，使用蘇木素染色5 min，伊紅染色2 min，清洗去除染色液后經90%、95%、100%的乙醇浸泡1 min，并將切片置于二甲苯中2次，每次1 min，滴加中性樹脂封片后于光學顯微鏡下觀察心肌梗死情況，并拍照記錄。

1.2.5TUNEL檢測大鼠心肌細胞凋亡

取心肌組織石蠟切片用二甲苯及各梯度乙醇脫蠟至水，然后使用無菌蒸餾水水化5 min后，用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)進行熱修復，分別經過3%H2O2甲醇液、0.1% TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反應混合液、POD轉化劑孵育及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，DAB 溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS 沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.2.6Western blot

給藥結束后，取各組大鼠心肌梗死區域組織于液氮保存，然后取大鼠心肌組織50 mg，加入250 μL RIPA蛋白裂解液和2.5 μL的PMSF蛋白酶抑制劑，研磨均勻后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加入上樣緩沖液后沸水浴使蛋白變性，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的AT1、CARP、cleaved-caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 AMI模型鑒定

心電圖檢測結果顯示，與假手術組比較，AMI組心電圖ST段明顯抬高，提示AMI大鼠造模成功，見圖1。

箭頭：SF段抬高。

2.2 桔梗皂苷D對AMI大鼠心臟功能的影響

與假手術組比較，AMI組大鼠LVEDD和LVESD均明顯升高，LVFS和LVEF明顯降低(P<0.05)。與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組LVEDD和LVESD明顯降低，LVFS和LVEF明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見表1。

2.3 桔梗皂苷D改善AMI大鼠心肌損傷

假手術組心肌細胞排列整齊，細胞核形態正常，無明顯病變；AMI組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞核萎縮，炎性細胞大量浸潤，病變明顯；桔梗皂苷D低、中、高劑量組大鼠心肌細胞病變得到明顯改善，心肌細胞排列較整齊，炎性細胞浸潤減少，治療效果呈劑量依賴性，見圖2。

A:假手術組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

2.4 桔梗皂苷D調控AMI大鼠心肌細胞凋亡

TUNEL結果顯示，與假手術組比較，AMI組心肌組織凋亡明顯增加(P<0.05)；與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組心肌組織凋亡明顯減少(P<0.05)，見圖3、4。

表1 桔梗皂苷D對AMI大鼠心臟功能的影響

A:假手術組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a：P<0.05，與假手術組比較；b：P<0.05，與AMI組比較。

2.5 桔梗皂苷D調控AMI大鼠心肌組織凋亡蛋白表達

Western blot結果顯示：與假手術組比較，AMI組心肌組織促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表達水平明顯增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05)；與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組大鼠心肌組織Bax和cleaved-caspase-3表達水平明顯下調，Bcl-2表達水平明顯上調(P<0.05)，見圖5、6。

A:假手術組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a:P<0.05，與假手術組比較；b:P<0.05，與AMI組比較。

2.6 桔梗皂苷D抑制AT1-CARP信號通路

Western blot 結果顯示，與假手術組比較，AMI組心肌組織AT1和CARP表達明顯增加(P<0.05)。與AMI組比較，桔梗皂苷D低、中、高劑量組AT1和CARP表達水平明顯減少(P<0.05)，見圖7、8。

A:假手術組；B:AMI組；C:桔梗皂苷D低劑量組；D:桔梗皂苷D中劑量組；E:桔梗皂苷D高劑量組。

a:P<0.05，與假手術組比較；b:P<0.05，與AMI組比較。

3 討 論

AMI是常見的心血管疾病，病死率高，且發病機制復雜。目前研究表明，AMI的發病與炎性反應、免疫、細胞凋亡等相關。桔梗皂苷D是中藥桔梗的主要成分[5-7]。研究表明，桔梗皂苷D能夠調控凋亡相關蛋白表達而治療肺癌和乳腺癌等腫瘤[8-10]，亦有研究表明桔梗皂苷D亦可調控大鼠體內的免疫細胞活性[11]。桔梗皂苷D是否可通過調控炎性反應、免疫、細胞凋亡等治療AMI尚未有明確報道。本研究通過手術構建大鼠AMI模型，然后給予低、中、高劑量的桔梗皂苷D進行治療，治療后檢測各組大鼠心臟功能，大鼠LVEDD和LVESD明顯降低，LVFS和LVEF明顯增加，說明桔梗皂苷D能夠改善AMI大鼠心臟功能；且HE染色結果顯示，桔梗皂苷D治療后AMI大鼠心臟結構損傷被明顯緩解，說明桔梗皂苷D能夠治療AMI大鼠心臟損傷。

AMI可促使心肌細胞因缺血缺氧而發生細胞凋亡，通過抑制心肌細胞凋亡可延緩心室重構并減少心肌梗死面積，既往研究報道指出心肌梗死后引發的心肌細胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病發生的細胞學基礎。所以，接下來本研究即探討了桔梗皂苷D是否可通過緩解AMI大鼠心肌細胞的凋亡而緩解心肌損傷，本研究通過TUNEL檢測心肌細胞凋亡，結果顯示，桔梗皂苷D能夠明顯抑制AMI大鼠心肌細胞的凋亡。Bax、Bcl-2、caspase-3均為凋亡相關蛋白，其中Bax和caspase-3具有促進細胞凋亡的作用，而Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用[12]。且桔梗皂苷D治療后促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達明顯下調，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達明顯上調，說明桔梗皂苷D能夠通過調控凋亡相關蛋白的表達而調控AMI大鼠心肌細胞凋亡。

心肌梗死后多種原因可誘發心肌細胞凋亡，其中，AT1受體被激活后p53的表達增加，進而降低Bcl-2和Bax的比值從而發揮促進心肌細胞凋亡的作用[13]。CARP屬于高度保守的肌肉錨定重復蛋白家族，主要在心臟中表達，且研究表明，CARP的表達能夠隨AT1受體激活而上調，提示AT1-CARP通路可能為引發心肌梗死后細胞凋亡的關鍵通路[14-15]。本研究表明，桔梗皂苷D治療后，AMI大鼠心肌細胞AT1和CARP表達明顯抑制，即AT1-CARP信號通路被明顯抑制，說明桔梗皂苷D能夠通過抑制AT1-CARP信號通路而緩解AMI大鼠心肌細胞凋亡。

綜上所述，桔梗皂苷D能夠改善AMI大鼠心臟功能及心肌損傷，其機制為通過抑制AT1-CARP信號通路而緩解AMI大鼠心肌細胞凋亡，但其臨床應用還需進一步研究。