重癥急性胰腺炎大鼠CARD9的早期表達及柴芩承氣湯的干預研究*

門昌君，張平平，劉 鈺，張國梁△，王東強

(1.天津市第一中心醫院消化科，天津 300192；2.天津市第一中心醫院中西醫結合科，天津 300192；3.天津醫科大學，天津 300070)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種以胰腺自身消化、壞死為主要特征引起的消化道組織水腫、胃腸道蠕動功能減退、黏膜屏障功能受損，并可引起全身炎性反應或導致多器官功能障礙的一種臨床綜合征[1]。因其病情進展快速、病死率高達30%～40%、預后差，易出現多器官衰竭(multiple organs dysfunction syndrome,MODS)，是臨床上常見的危重急腹癥[2]，并有近20%的急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)被診斷為SAP[3]。SAP發生后多種炎癥細胞被激活，釋放出白細胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-10及其他炎性因子并啟動全身炎性反應，導致胰腺組織細胞凋亡即“炎性介質瀑布樣級聯效應”[4-5]。因此，在SAP早期控制炎性反應和細胞凋亡，是提高患者的生存率和改善預后的重中之重。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9)是在巨噬細胞內高表達的一種新型蛋白，作為多數受體路徑的載體，可以激活多種炎性反應信號傳遞路徑，促進炎性因子的生成。有研究發現，在早期AP患者外周血中，CARD9 mRNA表達明顯增高，且磷酸化CARD9的表達水平與胰腺炎病情程度呈正相關[6]。柴芩承氣湯是在中醫“益活清下”治療思想下加用活血化瘀、行氣止痛化裁而成，以大黃、芒硝為主，輔以厚樸、黃芩、柴胡等中藥?，F代醫學認為，該方劑能清除腸道生物屏障，能清除腸源性內毒素、抑制蛋白酶激活和腸道細菌移位，清除血漿和組織內炎性反應遞質和氧自由基，阻斷感染作用[7]。研究發現，柴芩承氣湯作用于膽堿能通路上調巨噬細胞乙酰膽堿受體α7(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)的表達[8]，減少SAP炎性介質釋放及胰腺的病理損害[9]。本研究重點檢測SAP大鼠胰腺組織CARD9早期表達并探討柴芩承氣湯對病情的干預作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康SD大鼠60只，體重220～280 g，雌雄不限，待其適應國家衛生健康委員會危重病急救醫學重點實驗室(天津市第一中心醫院)的實驗室條件生存1周。實驗動物及其食用的標準飼料由天津醫科大學實驗動物中心提供，單籠飼養、自由飲食飲水，所有的實驗操作均符合《中國動物研究協會》的所有規定。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備

實驗動物術前禁食12 h，稱重后通過行腹腔內注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉。待全身麻醉后備皮，保持仰臥位。于劍下沿腹壁正中線開腹、暴露胃及十二指腸，確定十二指腸乳頭位置，肝臟下墊無菌棉保護肝組織，于肝門處與小動脈夾暫時夾閉膽管，于十二指腸乳頭開口插入1 mL注射器后將5%?；侨パ跄懰徕c(1.0 mL/kg)逆行進入膽胰管，注射速度約為0.2 mL/min。注射完畢待藥液擴散2 min后松開小動脈夾、拔出注射器、取出肝下無菌棉關閉腹腔。大鼠蘇醒后，可自由飲水、保持禁食的狀態，直至出現大鼠胰腺組織水腫、出血或壞死等改變時提示建模成功，見圖1。

A：開腹；B：夾閉肝門部膽管、保留胰膽管；C：逆行緩慢注入5%?；侨パ跄懰徕c；D：SAP模型胰腺。

1.2.2分組

將SD大鼠分為假手術組(SHAM組)、SAP組、柴芩承氣湯組(CQCQD組)，每組20只。SAP大鼠建模完成3 h后，SHAM組于開腹后翻動胰腺數次后縫合腹壁；按照10 mL/kg予CQCQD組柴芩承氣湯灌胃；SHAM組及SAP組均予生理鹽水灌胃。

1.2.3標本采集及檢測

(1)血清淀粉酶(AMY)：建模24 h后麻醉大鼠，經腹主動脈采血5 mL，離心后吸取上層透明血清標本分裝標記，—80 ℃保存檢測AMY。(2)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β：采用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4CARD9 mRNA表達水平檢測

采用RNA提取試劑盒提取胰腺組織中的總RNA，以其為模板逆轉錄生成cDNA。再按照實時熒光定量PCR(qRT-PCR) SYBR Green法步驟進行PCR擴增，qPCR條件：95 ℃預變性3 min；PCR循環為95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,擴增40個循環周期。循環完畢后進行熔解曲線分析。每個標本設3個復孔，經過3次獨立實驗后得到的數據，采用2-ΔΔCt值計算CARD9 mRNA的表達水平。PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa公司)，熒光定量PCR儀(LightCycler 96,瑞士羅氏公司)。CARD9上游引物：5′-ATT GAC CCC TCA CGA ATC AC-3′；下游引物5′-AGG AGC ACA CCC ACT TTC C-3′。內參U6上游引物：5′-TGC GGG TGC CTG CTT CGG CAG CAC-3′；下游引物：5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成。

1.2.5計算病理評分

術后3、6和12 h分批處死大鼠，取部分胰腺組織置于—196 ℃液氮罐保存；剩余胰腺組織置入甲醛固定液中24 h后，予液體石蠟包埋后以2 μm連續切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理學特征。從細胞水腫、炎性細胞浸潤、出血和脂肪壞死4個方面進行綜合評分。

1.2.6Western-blot法檢測CARD9蛋白磷酸化水平

50 μg蛋白上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠上，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；半干法轉印分離蛋白到聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜，1∶1 000一抗孵育PVDF膜，4 ℃過夜；二抗孵育PVDF膜1 h，ECL化學放光試劑發光顯色。

1.2.7中藥給藥方劑及配制

方劑組成：金銀藤30 g，蒲公英30 g，柴胡15 g，黃芩15 g，青香藤10 g，金鈴子10 g，陳皮10 g，大黃10 g，芒硝10 g。根據《動物實驗給藥劑量折算公式》計算給藥量，本研究中所用藥材均為“江蘇江陰天江藥業有限公司”生產的配方顆粒劑(批號：1701136)。顆粒劑混合后，加入蒸餾水800 mL攪拌直至溶解；后分裝為100 mL，于4 ℃冰箱保存，灌胃前給予37 ℃恒溫水浴鍋預熱。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 AMP、TNF-α及IL-1β水平變化

SAP組AMP、IL-1β水平隨造模時間延長而逐漸升高，TNF-α先升高后降低。與SHAM組比較，其炎性因子水平明顯升高(P<0.05)。同時間點CQCQD組AMP、TNF-α及IL-1β水平較SAP組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 胰腺組織中CARD9 mRNA水平變化

SAP組CARD9 mRNA水平隨著建模時間延長而逐漸升高。與SHAM組比較，SAP組CARD9 mRNA水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。同時間點CQCQD組CARD9 mRNA較SAP組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平變化

續表1 各組AMY、TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA水平變化

2.3 胰腺組織病理及評分

SHAM組胰腺組織結構清晰，偶見紅細胞及炎性細胞浸潤，未見腺泡小葉受損及腺泡細胞壞死。SAP組腺泡細胞變性壞死增多，小葉結構破壞更為明顯，炎性細胞及紅細胞浸潤增加，隨建模時間延長，胰腺病理評分增高。CQCQD組3、6、12 h胰腺組織病理損傷和評分[(5.9±0.4)、(8.9±1.7)、(10.1±1.1)分]均較SAP組[(9.9±1.9)、(11.6±2.5)、(12.8±2.4)分]低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A：SHAM組；B：SAP組；C：CQCQD組。

2.4 胰腺組織中CARD9蛋白的磷酸化檢測

以磷酸化CARD9條帶與β-actin條帶灰度值之比表示CARD9蛋白的磷酸化水平，在3、6及12 h時間點CQCQD組蛋白磷酸化水平較SAP組明顯下降，較SHAM組有所增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與SHAM組比較；b：P<0.05，與SAP組比較。

2.5 TNF-α、IL-1β、病理評分及CARD9 mRNA表達的ROC曲線分析

TNF-α表達水平的AUC值為0.842(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為78.4%、68.5%；IL-1β表達水平的AUC值為0.887(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為88.4%、91.0%；病理評分的AUC值為0.888(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為85.4%、92.2%；CARD9 mRNA表達的AUC值為0.923(P<0.05)，靈敏度和特異度分別為89.9%、94.8%。SAP大鼠模型CARD9 mRNA表達水平靈敏度、特異度及AUC值最高，有較高的診斷準確性，見圖4。

圖4 SAP大鼠模型ROC曲線

3 討 論

CARD9是1個重要的銜接蛋白，屬于包含CARD蛋白家族中的一員，定位于染色體9q34.3，CARD9 cDNA全長2 108 bp。其能與巨噬細胞內2個含有CARD 結構域的蛋白B細胞淋巴瘤因子10(B-cell lymphoma factor10，BCL10)、黏膜相關組織淋巴瘤易位蛋白(mucosa associated tissue lymphoma translocating protein，Maltl)結合，形成CARD9/Bcl10/Maltl復合體(CARD9復合體)。有研究發現，CARD9主要參與固有免疫炎性反應，而巨噬細胞在固有免疫炎性反應中起重要作用[10]。已有研究表明，CARD9作為核因子-κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎癥信號通路的上游分子，促進巨噬細胞產生和釋放炎性因子，對激活巨噬細胞起到重要作用[11]。目前已經證實，NF-κB與p38-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是SAP發病機制中調節促炎細胞因子產生的兩條主要通道[12-13]。本研究通過建立SAP大鼠模型，檢測各組各時間點TNF-α、IL-1β及CARD9 mRNA表達水平的變化，得出CARD9 mRNA隨建模時間延長的增高趨勢及與SAP的嚴重程度呈正相關；同時，SAP組大鼠AMY、TNF-α、IL-1β水平及胰腺病理評分均明顯升高且隨建模時間延長逐漸增加，驗證了CARD9等作為新靶標在SAP發病早期的標志性意義。

劉媛琪等[14]通過實驗研究發現，大黃可降低內毒素的吸收，抑制TNF-α和IL-1β的表達，有解熱、抗炎、鎮痛、抑制胃酸和胰蛋白酶分泌等作用[15]。XUE等[16]研究發現黃芩苷作用于SAP 大鼠時，可抑制NF-κB活化，減少TNF-α、IL-6表達，改善肝臟損傷。相關研究表明黃芩與柴胡配伍具有良好的保肝作用[17-18]。厚樸有抗病原微生物作用，芒硝可促進腸內毒素的排泄，枳實水煎液可促進胃腸蠕動。柴芩承氣湯可排除胃腸積滯、清除腸道內的細菌和內毒素，保護腸道的機械和免疫屏障，減輕全身炎性反應，減少MODS發生及病程，從而降低病死率[19-20]。本課題組將柴芩承氣湯引入動物實驗的對比研究，結果發現：大鼠的胰腺損傷程度隨建模時間延長逐漸加重，柴芩承氣湯可有效改善SAP早期病情；隨著病情進展胰腺組織中的CARD9 mRNA表達及磷酸化CARD9蛋白亦隨之增加；CQCQD組大鼠胰腺組織中CARD9 mRNA表達及磷酸化CARD9蛋白明顯低于同時間點的SAP組。本研究證實：柴芩承氣湯不僅可以降低SAP模型大鼠血清淀粉酶水平及胰腺病理損傷，而且可以降低血清CARD9 mRNA、TNF-α及IL-1β水平。提示SAP血清促炎因子升高可能與巨噬細胞存在CARD9 mRNA表達上調有關；早期給予SAP模型大鼠柴芩承氣湯可降低其血清TNF-α及IL-1β水平，可能是其下調巨噬細胞內質網CARD9 mRNA表達，抑制信號傳導及炎性因子的釋放，從而減輕SAP時胰腺減輕胰腺的病理損傷。

綜上所述，本研究首次將ROC曲線引入大鼠SAP模型的研究，通過ROC曲線分析發現SAP大鼠模型CARD9 mRNA表達水平較TNF-α、IL-1β、病理評分的靈敏度、特異度及AUC值高，提示有較高的診斷準確性，可以將其作為評估SAP病情的新靶標。但由于本研究樣本量有限，大鼠的個體性差異可能對實驗結果有影響。此外，課題組應同時制備多個臟器的病理切片來觀察柴芩承氣湯對多器官的保護作用。今后還應繼續收集臨床病例，進行大樣本量、多中心臨床實驗研究對動物實驗成果進行驗證。