“消疹方”水提液對鹽酸厄洛替尼所致小鼠皮膚毒性的治療作用研究及機制初探

邢海燕 劉玉萍 蔣祥亮 陳 彥

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥組分與微生態(tài)研究中心，江蘇南京 210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院腫瘤科，江蘇南京 210028）

以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點的抗腫瘤分子靶向治療藥物即EGFR抑制劑（EGFRI），如吉非替尼、厄洛替尼等，已被廣泛應用于肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的治療[1]。然而，由于EGFR在體內(nèi)的分布特點，該類藥物對皮膚及其附屬器官具有特殊的不良反應，其中以皮膚毒性最為常見也最難以耐受，一般于用藥后1周左右出現(xiàn)，發(fā)生率高達79%～88%。臨床大數(shù)據(jù)顯示，44%～100%服用EGFRI的患者會出現(xiàn)丘疹膿皰型皮疹，21%的患者會出現(xiàn)毛發(fā)再生異常尤其表現(xiàn)在頭發(fā)和眼瞼處，12%～16%的患者會出現(xiàn)皮膚干燥發(fā)癢，還有12%～16%的患者則會出現(xiàn)甲周炎癥和牙痛感等[2-4]。臨床常采用局部使用抗生素、類固醇或口服抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑及中藥進行治療[5]。中醫(yī)認為，這種藥物性皮疹屬“藥毒疹”“中藥毒”的范疇，主要由于患者素體稟賦不足，血熱內(nèi)蘊，復感藥物特殊之毒，致風、濕、熱毒等邪毒外達肌膚，多主張采用清熱解毒、清熱涼血、益氣養(yǎng)陰等治則治法進行防治[6-7]。“消疹方”為江蘇省國醫(yī)名師徐荷芬主任團隊常用的腫瘤輔助治療臨床驗方，臨床對EGFRI所致皮疹具有較好的療效[8]。本研究我們建立了EGFRI致皮膚毒性小鼠模型，考察消疹方的療效，并對其作用機制進行初步分析，為進一步研發(fā)和臨床使用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠（體質(zhì)量20 g左右，雌性），購自南通大學，合格證號：201702736，飼養(yǎng)于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物中心。本動物實驗符合國家及江蘇省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心規(guī)定的倫理學要求。

1.2 藥物與試劑 鹽酸厄洛替尼（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS號：183319-69-9）；消疹方中所有組成藥物飲片均購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房；脫毛膏（Nair公司）；克林霉素磷酸酯凝膠（湖北康正藥業(yè)有限公司）；干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10及IL-12A炎癥因子Elisa試劑盒（凱基生物有限公司）。

1.3 主要儀器 酶標儀（Thermo scientific，MULTISKAN GO）；倒置顯微鏡（奧林巴斯，IX73）；超低溫冰箱（TCL，BCD-118KA9）；超凈工作臺（ESCO公司，ESCOAC2）；純水儀（Millipore公司，TANKPE 060）；分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，F(xiàn)A2104）；臺式高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司，TG16W）；調(diào)溫電熱套（江蘇省通州市張芝山鎮(zhèn)決心化工電器廠，DW-2型）；剃毛器（Codos公司CP-5000）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 鹽酸厄洛替尼用去離子水配制成10 mg/mL的混懸液。消疹方水提液制備：取6倍處方量藥材（金銀花、紫草、土茯苓、連翹、浮萍、夏枯草、牡丹皮）共計840 g，加8.5 L水，煎煮1.5 h，提取2次，合并濾液，濃縮成4.50 g生藥量/mL的浸膏。

2.2 分組、造模與給藥 實驗小鼠共35只，飼養(yǎng)1周適應環(huán)境后按照體重隨機分為空白對照組、模型組、消疹方低劑量組、消疹方高劑量組和陽性藥物組。除空白對照組外其余4組參考文獻[9]的方法造模，前期按每日150 mg/kg灌胃鹽酸厄洛替尼，約2周后皮膚毒性反應開始出現(xiàn)，50 d左右達到高峰。50 d時通過肉眼觀察，各造模小鼠都出現(xiàn)了不同程度的四肢紅腫、毛發(fā)再生障礙及皰疹、皮疹，表明造模成功。造模第50日開始，在鹽酸厄洛替尼灌胃基礎上，消疹方低、高劑量組每日加用18 g/kg和45 g/kg消疹方水提液灌胃，并對小鼠患處進行擦洗，陽性藥物組每日加用克林霉素磷酸酯凝膠涂抹患處，空白對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水。各組給藥或生理鹽水均每日1次，持續(xù)15 d，給藥期間同時白熾燈光照10 h/d。

2.3 指標觀察

2.3.1 小鼠皮膚毒性的外觀和組織病理學觀察 干預期間觀察小鼠背部毛發(fā)再生狀況，四肢、嘴唇等裸露在外的皮膚變化。干預結(jié)束后，取小鼠背部皮膚做HE染色病理切片，觀察皮膚炎癥情況及表皮厚度。

2.3.2 免疫組化法檢測皮膚組織炎性蛋白表達 干預結(jié)束后，取小鼠皮膚組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚度的切片；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6）修復抗原后，將切片用PBS洗滌3次，并用3%BSA封閉；將切片分別與信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、非受體酪氨酸激酶janus激酶1（JAK1）一抗進行4 ℃孵育過夜，洗滌后，與二抗室溫孵育，PBS洗滌，DAB顯色試劑盒顯色。每個切片隨機選擇5個中等放大倍率顯微鏡場（×200），每組3張用ImageJ軟件計算陽性率并比較各組之間的差異。

2.3.3 Elisa法檢測血清炎癥因子 干預結(jié)束后，各組小鼠摘眼球取血，離心取血清，-80 ℃保存，根據(jù)試劑盒說明書采用Elisa法檢測各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-12A、IL-10及TNF-α含量。

2.4 統(tǒng)計學方法 使用Graphpad prism 7.0軟件作圖，統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，兩樣本間比較采用One-Way ANOVA檢驗，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組小鼠皮膚毒性的外觀和組織病理學比較 藥物干預期間模型組小鼠毛發(fā)停止生長，頸部、肩部、眼周脫毛癥狀繼續(xù)加重，嘴周和四肢皰疹、皮疹等癥狀加重，活動狀態(tài)較差。給藥15 d后，與模型組比較，消疹方低、高劑量組和陽性藥物組小鼠毛發(fā)再生長，胡須、眼周部分脫毛癥狀減輕，四肢紅腫程度顯著改善。見圖1。組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)：與空白對照組比較，模型組可見表皮明顯增厚（P＜0.0001），角質(zhì)層細胞增厚，嗜中性粒細胞在毛囊管外集群致毛囊炎癥；各給藥組小鼠表皮厚度明顯小于模型組（P＜0.05，P＜0.01），炎癥細胞聚集程度也較模型組明顯減輕；消疹方各劑量組與陽性藥物組比較未見顯著性差異（P＞0.05），作用相當。見圖2、圖3。

3.2 各組小鼠血清炎癥因子及皮膚組織STAT3、JAK1蛋白表達比較 結(jié)果見表1、圖4。與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-10、IL-12A、IL-2、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，消疹方高劑量組與陽性藥物組IL-2、TNF-α、IL-6、IFN-γ表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并接近空白對照組。表明消疹方防治厄洛替尼誘導的皮膚毒性可能與其下調(diào)炎癥因子有關。研究發(fā)現(xiàn)，EGFRI可通過增加JAK/STAT3的表達來誘導基底角質(zhì)形成細胞生長的停止、早熟，中性粒細胞分化和炎性因子釋放。免疫組化結(jié)果證實鹽酸厄洛替尼顯著增加了模型組STAT3，JAK1的表達（P＜0.001，P＜0.0001），而消疹方水提液和陽性藥物可顯著減少這種異常高表達的炎癥蛋白（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.0001），其中消疹方高劑量組與陽性藥物組作用相當（P＞0.05），見圖5。上述結(jié)果提示消疹方通過減輕因EGFRI引起的皮膚炎癥起到皮膚保護的作用。

圖1 干預后各組小鼠背部、四肢、眼瞼及唇周皮膚情況比較

圖2 干預后各組小鼠皮膚組織病理學比較（×200）

圖3 干預后各組小鼠表皮厚度比較（n=3）

表1 干預后各組小鼠炎性細胞因子含量比較（） 單位：pg/mL

表1 干預后各組小鼠炎性細胞因子含量比較（） 單位：pg/mL

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖4 各組小鼠皮膚組織炎癥蛋白表達比較（×200）

圖5 各組小鼠皮膚組織炎癥蛋白表達比較

4 討論

厄洛替尼是一種分子靶向抗腫瘤藥物，在抗癌過程中可特異性地通過抑制人體細胞內(nèi)表皮生長因子上的一種特定酶的活性，進而抑制腫瘤細胞的形成、生長或促進腫瘤細胞凋亡，達到抗腫瘤的目的。目前厄洛替尼被證實對晚期非小細胞肺癌具有可靠療效，能有效提高病人的帶瘤生存率。但在臨床使用的過程中，很多患者出現(xiàn)了不同程度的皮膚相關不良反應，出現(xiàn)皮疹、干燥、瘙癢等，這種皮膚毒性往往被認為是小分子靶向抗癌藥物起效的象征，然而卻影響了患者的生活質(zhì)量，嚴重的皮膚毒性甚至會導致腫瘤治療的中斷及抗腫瘤治療的失敗。因此，對于EGFRI所致的皮膚毒性的治療越來越受到重視，尋找相關的治療手段和藥物十分必要。

在動物模型建立方面，我們選用鹽酸厄洛替尼作為皮疹模型的誘導劑，并在給藥的過程中使用光照進一步促進皮膚不良反應的產(chǎn)生。我們根據(jù)文獻報道選擇克林霉素磷酸酯凝膠作為陽性對照，克林霉素磷酸酯凝膠在臨床上常用于治療EGFR抑制劑所致腫瘤患者皮疹，具有較好的療效。克林霉素磷酸酯凝膠屬于抗生素類藥物[10]，長期使用會產(chǎn)生耐藥性，降低其療效，且EGFRI導致的皮膚毒性往往是全身性的，局部涂抹療效有限。消疹方具有清熱解毒、祛濕散結(jié)、涼血透疹的功效。方中金銀花、紫草為君，清熱解毒、涼血透疹；土茯苓、連翹、浮萍為臣，能夠加強疏風、透疹、清熱、祛濕的作用；夏枯草、牡丹皮為佐，清熱、活血、散結(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)消疹方高劑量口服、擦洗給藥可達到與克林霉素磷酸酯凝膠類似的治療結(jié)果。

此外，在皮膚毒性的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥是其關鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平與皮膚毒性分級顯著相關[11]。TNF-α水平升高可刺激釋放并增加細胞因子（例如IL-2）的數(shù)量，導致細胞因子之間的平衡被打破；IL-6可以由很多細胞產(chǎn)生，如活化的T細胞和B細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞等，有炎癥產(chǎn)生時會促進IL-6的表達[12-13]。本研究結(jié)果證實，鹽酸厄洛替尼可以誘導大多數(shù)促炎因子的釋放，例如IL-10、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-12A，而消疹方水提液可以將它們降至正常水平。JAK-STAT信號通路功能廣泛，參與很多重要的生物過程，其中炎癥性疾病主要有銀屑病、特應性皮炎、犬皮炎等[13]，在炎癥的過程中表達增多。本研究結(jié)果表明，消疹方水提液可以抑制鹽酸厄洛替尼誘導炎癥的產(chǎn)生從而產(chǎn)生皮膚保護作用。

綜上，消疹方水提液可以緩解鹽酸厄洛替尼所致皮膚毒性，改善生活質(zhì)量，其機制可能與其抗炎作用有關。在后續(xù)的實驗中，我們將進一步明確消疹方通過哪些具體的抗炎相關信號通路產(chǎn)生皮膚保護作用，也將繼續(xù)觀察消疹方水提液對鹽酸厄洛替尼抗腫瘤效果的影響，還將優(yōu)化消疹方水提液的提取方案，盡可能多保留其揮發(fā)性成分。