乳酸桿菌抑制致病菌及生物保鮮發酵劑特性評價

徐顯睿，李翠鳳，張宗博，夏文洋，隋勇軍，李道河，陳政言，張蘭威*

（1.青島根源生物技術集團有限公司食品實驗室，山東 青島 266000；2.青島諾和諾康實業有限公司，山東 青島 266000；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266000）

乳酸桿菌是人體腸道優勢益生菌群，具有維持腸道菌群平衡[1]、提高免疫力[2]、抑制有害菌生長[3]、預防致病菌引起的腸道疾病[4]等功能，對促進腸道和宿主健康有重要作用[5]。乳酸桿菌定植于腸道上皮細胞，代謝過程中產生有機酸、過氧化氫以及多糖、抗菌肽、細菌素等蛋白類抑菌物質[6-7]。有機酸可降低腸道pH值、過氧化氫的積累抑制致病菌生長，而蛋白類抑菌物質可直接殺滅致病菌。田芬等[8]研究表明，3 株乳雙歧桿菌和2 株嗜酸乳桿菌對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用；孫群等[9]發現，副干酪乳桿菌X11、K14對腐敗熒光假單胞菌有很好抑制效果，經分析抑菌代謝物均為有機酸。傅容輝等[10]研究表明，5 株乳酸桿菌代謝產生細菌素等蛋白類物質和有機酸，對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和熒光假單胞菌均表現出良好抑制作用。此外有研究表明，乳酸桿菌黏附性也可抑制腸道致病菌[11]。

由于乳酸桿菌抑菌性具有單菌株特異性[12]，且低溫酸乳、風味發酵乳、乳酸菌飲料和干酪等發酵類乳品是乳酸桿菌產品消費產業鏈最重要的載體，尤其低溫酸乳和風味發酵乳保持每年20%消費增長，因此將具有抑菌性的乳酸桿菌制成發酵劑，在防腐保鮮功能基礎上使發酵劑的發酵性能適用于多種發酵乳制品的生產，具有較好的市場應用潛力。本研究中的乳酸桿菌是經耐胃腸液、細胞黏附性體外實驗篩選、具有優良潛在益生效果的食品菌株[13]，通過抑制腸道致病菌作用評價各菌株抑菌效果，再經單菌株凝乳及產酸性能測試，篩選同時具有優良發酵和抑菌性能的菌株與嗜熱鏈球菌ST-21制備組合生物保鮮發酵劑，評價各發酵劑特性，旨在為制備的生物保鮮發酵劑在發酵乳制品中的商業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 株可用于食品中的乳酸桿菌（分別為Z-41、Z-5、Z-12、Z-15、Z-38、Z-39、Z-1、Z-8、Z-7、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40、Z-43）、嗜熱鏈球菌ST-21、5 株指示菌株（單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌） 青島根源生物技術集團有限公司；動物雙歧桿菌乳亞種BB-12美國杜邦公司。

MRS肉湯培養基 北京陸橋技術股份公司；瓊脂北京索萊寶科技有限公司；TSA-YE培養基、LB液體培養基 青島海博生物技術有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純） 國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50SⅡ立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；AG050厭氧培養罐 廣州雷得生物技術有限公司；SE6001FZH電子天平 美國奧豪斯公司；1-7離心機 德國Sigma公司；PHS-3C pH計上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-250生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司；MX-S旋渦振蕩器 美國賽洛捷克公司；756PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；iCinac乳品發酵檢測儀 法國AMS Alliance公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

乳酸桿菌活化：將供試乳酸桿菌菌株按體積分數2%接種量接種到MRS肉湯培養基中進行活化（雙歧桿菌屬添加0.1%L-半胱氨酸鹽酸鹽），經2 次傳代，37 ℃恒溫培養箱中靜置培養（雙歧桿菌屬厭氧培養）24 h后待用。

指示菌活化：將指示菌以體積分數2%接種量接種于LB液體培養基中（單核細胞增生李斯特氏菌接種到TSA-YE培養基），37 ℃培養24 h，活化2 代后用于后續實驗。

1.3.2 無細胞抑菌活性上清液制備

將乳酸桿菌接種到液體培養基中，37 ℃培養24 h，于4 ℃、8 000×g離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜去除菌體和其他雜質后4 ℃保存備用。

1.3.3 乳酸桿菌抑菌能力測定及排除有機酸實驗

將指示菌稀釋至107CFU/mL，用移液槍取0.1 mL菌懸液接種到相應指示菌固體培養基中，混勻后用無菌涂布器涂至均勻。將3 個無菌的牛津杯均勻放置在培養皿中，取1.3.2節上清液0.2 mL注入牛津杯中（排除有機酸實驗需用1 mol/L NaOH將1.3.2節上清液pH值調整至6.0），在4 ℃冰箱中擴散2 h后37 ℃培養24 h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小評價抑菌能力。

1.3.4 乳酸桿菌凝乳及產酸性能測試

將1.3.3節乳酸桿菌接種到質量濃度12 g/100 mL滅菌脫脂乳中，按2%接種量發酵5 代，經37 ℃培養48 h，初步篩選出凝乳狀態穩定的菌株。再將上述菌株按2%接種量接種到12 g/100 mL滅菌脫脂乳中，37 ℃發酵，采用乳品發酵檢測儀測定發酵48 h內的pH值。

1.3.5 生物保鮮發酵劑產酸性能測試

表 1 組合菌種制備生物保鮮發酵劑配方Table 1 Formulation of bio-preservative starter cultures

將嗜熱鏈球菌S-21與上述篩選出具有抑菌和優良產酸性能的乳酸桿菌組合制備生物保鮮發酵劑，按表1配方以3%接種量接種于滅菌脫脂復原乳中，于43 ℃發酵48 h，采用乳品發酵檢測儀連續測定pH值。

1.3.6 生物保鮮發酵劑發酵乳質構測定

采用生物保鮮發酵劑在43 ℃發酵復原乳，當pH值至4.55左右時于4 ℃放置48 h，采用TAX-XT2i質構分析儀測定產品硬度、稠度和黏聚性。測定條件：選用A/BE探頭，壓力盤直徑35 mm。設置參數：下降速率1.0 mm/s，測試速率1.0 mm/s，上升速率10.0 mm/s，測試深度30 mm，記錄整個過程中所需應力。探入過程中的最大峰值為硬度（g），探頭上行的負峰值為黏聚性（g），曲線正峰面積為稠度（g·s）。

1.3.7 生物保鮮發酵劑發酵乳感官評價

采用生物保鮮發酵劑在43 ℃發酵復原乳，當pH值至4.55左右時于4 ℃放置48 h，選擇10 名具有感官評定經驗的食品專業人員進行評分，感官評價標準如表2所示。

表 2 發酵乳感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

1.4 數據處理

采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸桿菌對腸道致病菌抑制作用實驗結果

由表3可知，菌株Z-41、Z-12、Z-38、Z-17、Z-45、Z-46、Z-16、Z-40和Z-43共9 株菌對5 株指示菌均有抑制效果，其中菌株Z-17對單核細胞增生李斯特氏菌抑菌效果最好，Z-12對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌抑菌效果最好，Z-38對腸炎沙門氏菌和大腸桿菌抑菌效果較好。除單核細胞增生李斯特氏菌外，菌株Z-5、Z-7對其余4 株指示菌均有抑菌效果，并且2 株菌對大腸桿菌抑菌效果也較好，抑菌圈直徑分別為17.76、13.40 mm。菌株Z-8對腸炎沙門氏菌和大腸桿菌有抑制效果，Z-1和Z-15對大腸桿菌有抑制效果，但上述乳酸桿菌抑菌能力均明顯高于動物雙歧桿菌乳亞種BB-12（僅對大腸桿菌有抑制作用，抑菌圈直徑為11.37 mm）。

表 3 乳酸桿菌抑菌作用結果Table 3 Antagonistic effect of Lactobacillus strains against pathogens

此外，實驗結果還表明，上述乳酸桿菌排酸上清液對5 株指示菌均沒有抑制效果，說明本研究中的乳酸桿菌對5 株指示菌產生抑菌效果的主要物質是有機酸類。Saleh等[16]研究表明，動物雙歧桿菌乳亞種BB-12對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制作用，對單核細胞增生李斯特氏菌無抑制作用，與本研究結果不一致，可能與致病菌菌株特異性或動物雙歧桿菌乳亞種BB-12經分離、活化傳代導致性狀突變有關。

2.2 乳酸桿菌凝乳及產酸性能測試結果

乳酸桿菌利用乳中乳糖生長代謝產生乳酸，降低復原乳的pH值，使酪蛋白達到等電點，進而使復原乳完全凝固，并且菌株在傳代過程中，由于DNA復制基因存在突變，因此為使菌株發酵特性穩定，對菌株進行傳代并分別評價其凝乳性能。

表 4 乳酸桿菌凝乳性能測試結果Table 4 Milk curding ability of 15Lactobacillus strains

圖 1 乳酸桿菌產酸性能測試結果Fig. 1 Acid production ability of Lactobacillus strains

由表4可知，15 株乳酸桿菌的凝乳能力不同。菌株Z-41、Z-5、Z-15、Z-39、Z-1、Z-16在乳中48 h內基本不生長，而菌株Z-17則表現為凝乳狀態不穩定，經2 次傳代后凝乳能力消失。菌株Z-12、Z-38、Z-8、Z-7、Z-45、Z-46、Z-40、Z-43凝乳狀態穩定，其中菌株Z-43凝乳狀態一般，其他菌株凝乳狀態較好。因此為保證制備的生物保鮮發酵劑能適合多種酸乳制品發酵、生產的要求，測定上述凝乳狀態穩定的8 株乳酸桿菌發酵48 h的產酸速率，評價產酸性能。由圖1可知，8 株乳酸桿菌在發酵48 h的產酸趨勢基本一致。菌株Z-46、Z-7產酸速率較快，發酵24 h使復原乳pH值降至4.4左右，此時其他菌株的發酵復原乳pH值為4.6～5.0，基本使復原乳凝固。此外，在脫脂復原乳pH值至4.5左右時，8 株乳酸桿菌仍具有較快的產酸速率，后酸化水平均較差，其中菌株Z-7發酵終止時pH值為3.75，其余7 株菌株發酵終止時pH值在4.0左右，基本相同。因此從乳酸桿菌抑菌效果、凝乳狀態及穩定性、產酸速率綜合考慮，選擇菌株Z-12、Z-38、Z-40、Z-46共4 株乳酸桿菌與嗜熱鏈球菌ST-21進行組合，制備生物保鮮發酵劑。

2.3 生物保鮮發酵劑產酸性能測試結果

圖 2 生物保鮮發酵劑產酸性能測試結果Fig. 2 Acid production ability of eight bio-preservative starter cultures

由圖2可知，各發酵劑配方產酸趨勢基本一致。配方3、7、8產酸速率最快，發酵5 h時pH值達到4.6左右；配方2產酸最慢，其他配方產酸速率一般，所有配方后酸化水平相對較好。因此，從產酸指標考慮，配方3、7、8適合生產風味發酵乳和乳酸菌飲料，但需同時考慮質構和感官特性，產酸快，后酸化平緩可縮短發酵時間，保持產品質量穩定。Fox等[17]研究表明，產酸過快易導致干酪凝塊破碎，而產酸過慢則使凝塊彈性不足，在上述發酵劑中配方2產酸最慢，但與李星科[18]、周海珍[19]等篩選干酪發酵劑的產酸速率基本一致，而且用于制作干酪的發酵劑主要為乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳脂明串珠菌等嗜溫發酵劑，產酸速率一般，或嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌等嗜熱發酵劑，產酸速率較快，但嗜熱型干酪發酵劑主要為單菌種發酵[20-21]。此外，現代干酪生產主要采用混合菌種發酵，減少噬菌體危害程度[22]，且近年多以嗜熱鏈球菌與中溫菌混合發酵制備切達干酪[23]，因此從菌種組成和產酸性能分析，配方2可作為嗜溫型干酪發酵劑。

2.4 生物保鮮發酵劑發酵乳質構測定結果

表 5 不同生物保鮮發酵劑發酵乳質構特性Table 5 Texture properties of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

由表5可知，后熟48 h不同生物保鮮發酵劑發酵乳的質構不同。發酵乳硬度、稠度和黏聚性基本呈正向關，且與pH值有關[24]。配方7、8發酵乳在硬度、稠度和黏聚性方面突出主要與單菌株特異性有關，并且有研究表明，發酵乳黏稠度高適合生產乳酸菌飲料，可降低乳飲料離心沉淀率[25-26]。但陸延等[27]指出，發酵乳黏度越大，飲料穩定性越差，離心沉淀率越高，與上述理論和實際生產相矛盾，這可能是由于高黏度發酵劑產胞外多糖較多，與酪蛋白結合使飲料粒徑增大，加快沉降速率，同時和僅添加大豆多糖并不適合構建殺菌型乳飲料穩定體系有關。配方2發酵乳的黏稠度小，有利于干酪中乳清的處理，適合用于干酪發酵劑[28]。此外其他配方質構差異無規律，可能與乳酸桿菌菌株特異性和接種量有關。乳酸桿菌接種量增加，共生作用使產酸加快，pH值降低，發酵乳硬度增加；但嗜熱鏈球菌ST-21接種量降低，可能影響胞外多糖的產生，使發酵乳黏稠度下降[29]。

2.5 生物保鮮發酵劑發酵乳感官評價結果

由表6可知，發酵乳后熟48 h后在組織狀態、風味和口感方面沒有顯著差異，表現均較好，其中配方3發酵乳風味較突出，配方7、8發酵乳在組織狀態和口感方面表現較好，可能均與Z-38、Z-40菌株特異性有關，而配方2發酵乳在風味和口感上表現一般，可能與菌株Z-12蛋白水解能力有關。蛋白質水解是成熟干酪在后熟中風味和質構形成最重要的反應，由于干酪成熟期一般在6 個月以上，蛋白水解度大的菌株可能產生苦味多肽類物質，而由于風味發酵乳貨架期較短，蛋白分解產生的短肽和氨基酸對產品流通期間的風味不易產生不良影響[30]，這可能也解釋了配方3適宜制作風味發酵乳，配方2可用于制作干酪。

表 6 不同生物保鮮發酵劑發酵乳的感官評價Table 6 Sensory evaluation of yogurt fermented by eight different bio-preservative starter cultures

3 結 論

對15 株乳酸桿菌進行抑菌、凝乳、產酸實驗，篩選得到Z-12、Z-38、Z-40和Z-46 4 株乳酸桿菌對單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有明顯抑制效果，且表現出良好的凝乳和產酸性能。將上述4 株乳酸桿菌分別與嗜熱鏈球菌ST-21按不同比例組合制備生物保鮮發酵劑，測試發酵劑產酸和質構特性，并對發酵乳進行感官評價，其中發酵劑配方3在發酵5 h使發酵乳pH值降至4.6，后酸平緩，具有奶油香氣，適用于生產風味發酵乳。用發酵劑配方7制備的發酵乳質構特性最好（硬度117.31 g、稠度2 846.18 g·s、黏聚性-77.87 g），適用于生產乳飲料。而用發酵劑配方2制備的發酵乳質構特性最小（硬度78.04 g，稠度1 562.67 g·s，黏聚性-28.31 g），適合生產干酪。