不同年份番石榴葉茶理化成分及抗氧化活性研究

李孔會，廖森泰，鄒宇曉，李 倩

（1.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】番石榴（Psidium guajava）為桃金娘科番石榴屬植物，亞熱帶果樹，主要生長在我國廣東、廣西、海南、臺灣、福建等熱帶及亞熱帶地區［1］，其中在廣東省惠州、茂名等地區種植較多。番石榴葉是指番石榴的干燥葉子或者帶葉嫩莖，其氣清香、味澀、甘苦［2］，含有較豐富的營養物質以及微量元素，且富含多酚、黃酮、多糖等活性物質。番石榴葉作為一種天然果樹自然資源，在墨西哥、秘魯的民間食用歷史悠久，常用番石榴葉煎煮來治療腹瀉，預防肥胖和糖尿病等［3］。廣東省近年來加大資金和科研力量的投入，不斷引進和培育番石榴新品種，建立番石榴種質資源圃和標準化示范園，對現有番石榴品種進行收集和保護，并推廣新品種［4-5］，當前番石榴資源的利用主要以鮮銷果肉為主，而大量番石榴葉未得到充分利用。研究番石榴葉茶的理化特性和功能活性隨貯藏時間的變化規律，掌握番石榴葉茶不同沖泡時間的抗氧化活性，可為番石榴葉茶質量評估標準提供參考，為番石榴副產物綜合利用奠定理論基礎。

【前人研究進展】目前針對番石榴葉的功能性研究較多，已有研究表明番石榴葉具有抗氧化、降血糖、抗腹瀉、止血、抗癌等功效［6-10］。葉偉［6］對不同番石榴葉有機溶劑提取物的抗氧化活性進行測定，提出番石榴葉提取物具有開發抗氧化抗衰老藥物以及酪氨酸酶抑制劑的應用前景。沈靜［7］將番石榴葉提取物作用于糖尿病小鼠，得出番石榴葉提取物可能通過上調PI3K/Akt發揮降糖作用，改善胰島素抵抗的結論。鄔亞男［3］通過混菌固態發酵，提高番石榴葉中活性物質的含量，并與β-環糊精形成包容物，提高其水溶性及生物利用度。這些研究都為番石榴葉的加工利用提供理論基礎，我國一些茶廠將番石榴葉加工制成保健型茶產品，然而當前尚未有文獻系統評估番石榴葉茶的功能性物質含量及活性。

【本研究切入點】本試驗以不同年份的番石榴葉茶作為研究對象，比較其香氣成分，判斷是否具有茶類產品的風味成分；比較功能成分含量和活性強弱，以評估番石榴葉茶功能性及貯藏穩定性。【擬解決的關鍵問題】本研究旨在評估不同年份番石榴葉茶的理化特性，探索貯藏過程中功能活性的變化，明確抗氧化能力最強的沖泡時間段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的番石榴葉茶由廣東名揚生物科技有限公司提供，經廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所鑒定為番石榴（Psidium guajava）葉。兩個樣品分別于2018年4月、2019年4月生產（簡稱樣品A、樣品B），兩者加工工藝（圖1）完全相同。通過比較分析兩個樣品的理化性質，明確番石榴葉茶的儲存特性和生物活性，為其在食品中的應用提供理論基礎。

試劑：福林酚試劑，上海荔達生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），蘇州亞科科技有限公司；焦性沒食子酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、無水葡萄糖，天津市福晨化學試劑廠；抗壞血酸（VC）、苯酚，天津市大茂化學試劑廠；鹽酸（HCl）、濃硫酸（H2SO4），廣州化學試劑廠；α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），上海瑞永生物科技有限公司。以上所有化學試劑均為分析純。

儀器與設備：N-100旋轉蒸發儀，上海愛郎儀器有限公司；6890N Network GC System氣相色譜-質譜聯用，安捷倫科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計，島津企業管理（中國）有限公司；Synergy H1酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品提取 （1）固相萃取：番石榴葉茶粉碎過0.425 mm篩，稱取0.3 g，加入6 mL沸水于頂空瓶中，室溫下平衡5 min，置55 ℃的水浴磁力攪拌器中，插入萃取頭吸附60 min。（2）水提取制備：參照羅思媛等［11］的方法，料液比改為1∶60，在浸泡15、30、45、60 min時，收集水提物，備用。（3）采用乙醇浸提，超聲輔助法提取多酚，具體步驟參照沈維治等［12］的方法。（4）水提醇沉法提取多糖，參考楊燁［13］的方法。

1.2.2番石榴葉茶香氣成分測定 氣相色譜質譜條件參照胡西洲等［14］的方法，程序升溫和質譜條件不變，分流比為20∶1。

1.2.3番石榴葉茶多酚含量測定 以沒食子酸標準溶液繪制標準曲線，參照程沁園等［15］的方法，采用福林酚法測定多酚含量。

1.2.4番石榴葉茶多糖含量測定 以葡萄糖標準溶液繪制標準曲線，參考彭珊珊等［16］的方法，采用苯酚硫酸法測定樣品葡萄糖的含量，計算總多糖含量。

式中，C為樣品溶液葡萄糖的濃度，μg/mL；D為樣品定容體積，mL；M為總多糖質量，g。

1.2.5番石榴葉茶水提物抗氧化活性測定 參照符春麗等［17］的方法測定番石榴葉茶的抗氧化活性，以VC為陽性對照，各組平行測定3次，取平均值。

（1）番石榴葉茶水提物對DPPH自由基清除能力的測定：取樣品溶液2 mL、DPPH自由基溶液2 mL，充分混勻后避光反應30 min，于517 nm處測定吸光度A樣品，計算DPPH自由基清除率。

式中，A背景為無水乙醇代替DPPH；A空白為無水乙醇代替樣品。

（2）番石榴葉茶水提物對羥基自由基清除能力測定：取鄰二氮菲乙醇溶液1.5 mL、磷酸鹽緩沖液3 mL，混勻后依次加入FeSO4溶液1.0 mL、樣品溶液3.0 mL、雙氧水1.0 mL，混勻，37 ℃反應1 h，于536 nm處測定吸光值A樣品，計算羥基自由基清除率。

式中，A損傷為無水乙醇代替樣品；A未損傷為雙蒸水代替雙氧水，無水乙醇代替樣品。

（3）番石榴葉茶水提物對超氧陰離子清除能力測定：在試管中依次加入Tris-HCl緩沖液2.25 mL、樣品溶液2 mL、鄰苯三酚0.2 mL，混勻，常溫條件下反應30 s，加入0.5 mL鹽酸溶液終止反應，于320 nm下測定吸光度A樣品，計算超氧陰離子清除率。

式中，A空白為無水乙醇代替樣品。

（4）番石榴葉茶水提物對α-葡萄糖苷酶抑制活性測定：參照龍曉珊［18］的方法，以阿卡波糖為陽性對照，在96孔板中加入樣品溶液50 μL、α-葡萄糖苷酶溶液（用磷酸緩沖溶液配制） 25 μL，混勻，37 ℃反應10 min，加入PNPG溶液（用磷酸緩沖溶液配制） 25 μL，混勻后37 ℃反應30 min，加入碳酸鈉溶液100 μL終止反應，在酶標儀450 nm波長處測定吸光度A樣品，計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中，A背景為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液；A空白為磷酸緩沖溶液代替樣品。

試驗數據采用Miceosoft Excel軟件整理，用SPSS軟件進行處理和單因素方差分析，用Origin軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同年份番石榴葉茶香氣成分的比較

通過氣相色譜質譜檢測，樣品A中檢測到69種香氣成分，樣品B有52種，表明樣品A中的香氣成分更加豐富。經分析，番石榴葉茶中的香氣成分可分為萜類化合物、揮發油和其他三大類，其中萜類化合物最多，如β-石竹烯、（-）-藍桉醇、α-姜黃烯等；揮發油類物質次之，如（+）-香橙烯、香樹烯、苯甲醛等（表1）。苯甲醛是茶葉的香氣成分之一［19］，在黃茶［20］和白茶［21］中也存在，說明番石榴葉茶可作為茶葉飲用。

表1 不同年份番石榴葉茶中的主要香氣成分Table 1 Main aroma components in guava leaf tea in different years

2.2 不同年份番石榴葉茶多酚含量的比較

福林酚法為測定總多酚的常用方法，試驗所測得的沒食子酸標準曲線的回歸方程為Y=0.0116X+0.0863，R2=0.9996。由表2可知，番石榴葉茶經乙醇浸提后，樣品A的多酚含量為34.23 mg/L，樣品B的多酚含量為40.93 mg/L，樣品B中的多酚含量較樣品A多，說明茶葉在貯藏過程中，多酚類物質發生了降解，可能與貯藏環境或多酚本身的性質有關。

表2 不同年份番石榴葉茶中的多酚和多糖含量比較Table 2 Comparison of polyphenol and polysaccharide contents in guava leaf tea in different years

2.3 不同年份番石榴葉茶多糖含量的比較

葡萄糖標準曲線的回歸方程為Y=0.0081X+0.1443，R2=0.9997。由表2可知，番石榴葉茶經水提醇沉后，樣品A的多糖含量為11.36 mg/g，樣品B的多糖含量為6.95 mg/g，可看出樣品B中的多糖含量較樣品A少，這是由于提取物為水提物，葉茶在貯藏過程中微生物參與反應，從而水溶性多糖含量增多。

2.4 不同年份番石榴葉茶抗氧化活性的比較

在比較番石榴葉茶對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子抗氧化活性的過程中，均以VC作為陽性對照，1 mg/mL的VC對3者的清除率分別為97.26%、90.84%、98.14%。由圖2可知，兩個樣品對3種自由基均具有一定的清除能力，且樣品B的抗氧化活性高于樣品A，說明番石榴葉茶具有抗氧化活性，且以貯藏時間較短的樣品B抗氧化活性較好。

圖2顯示，不同浸泡時間茶湯對自由基的清除能力具有相同的變化趨勢，均為先上升后下降，兩個樣品的變化趨勢也相同。浸泡30 min時，樣品A、B對DPPH自由基和超氧陰離子的清除能力均達到最大，對DPPH自由基的清除率分別為57.62%、60.11%，與其他時間點差異顯著，對超氧陰離子的清除率分別為21.83%、23.55%；浸泡45 min時，樣品A、B對羥基自由基的清除率達到最大，清除率分別為74.81%、93.89%。說明番石榴葉茶的沖泡時間為30～45 min時具有最強的抗氧化活性。

2.5 不同年份番石榴葉茶對α-葡萄糖苷酶抑制活性的比較

如圖3B所示，番石榴葉茶可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且與樣品質量濃度呈正相關。當樣品質量濃度為1.5 mg/mL時，樣品A和樣品B對α-葡萄糖苷酶活性均有抑制效果，抑制率分別為94.66%和79.96%，且樣品A抑制效果顯著高于樣品B；阿卡波糖（圖3A）、樣品A、樣品B對α-葡萄糖苷酶活性半抑制率（IC50）的濃度分別為1.86、0.79、1.1 mg/mL，說明番石榴葉茶對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性，且貯藏時間較久的樣品A抑制效果更強，優于陽性藥物阿卡波糖。

3 討論

番石榴葉作為一種天然的果樹自然資源，民間常用來煎煮治療腹瀉及預防肥胖和糖尿病等［3］。莫單丹等［22］對番石榴葉炮制品進行顯微特征、薄層色譜鑒別，測定其水分、總灰分、酸不溶性灰分以及有效成分槲皮素的含量，并以此建立了質量評價標準。已有研究表明，番石榴葉提取物的抗氧化能力與多酚及黃酮含量有關且呈線性相關，同時其中的多糖對碳水化合物水解酶具有較強的抑制能力［23］。番石榴葉茶因加工工藝的差異，普遍存在理化性質不穩定和功能性成分損失的現狀，然而針對番石榴葉茶開展的理化性質及質量標準的研究并不多見。因此，本試驗對番石榴葉茶中的多酚及多糖進行提取，測定其含量，后對其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制作用進行測定。

香氣是人們評價茶葉的重要指標之一，本試驗中，番石榴葉茶的香氣成分主要為萜類化合物和揮發油物質，與Borah等［24］所測得的番石榴葉香氣成分相似。除此之外，在番石榴葉茶中還檢測到了苯甲醛，中國茶學辭典提到苯甲醛為茶葉中的特征香氣成分之一［19］，說明番石榴葉具有向茶葉產品加工方向發展的潛質。

本試驗結果顯示，番石榴葉茶貯藏時間越長，其多酚含量越少，多糖含量越多，推測在貯藏過程中多酚發生降解，而多糖由于微生物的參與導致含量增加。胡紹德等［25］對16種不同年份黑茶的多酚含量以及成分進行研究，得到年份越久的黑茶中多酚含量越少、兒茶素含量也較低的結論，說明多酚類物質長期儲存會發生降解。張佳欣［26］對不同年份茯苓茶中水溶性多糖的含量以及多糖組分的研究結果顯示，茯磚茶多糖隨著陳化時間的增加而略有增加，多糖成分中中性糖為主體成分。說明在貯藏過程中，茶葉的成分在發生變化，部分不溶性多糖因為微生物的參與轉變為可溶性多糖，以致水提物中多糖含量增加。

周先榮等［27］測定2008、2012、2016年普洱茶的體外抗氧化活性結果顯示，3個年份普洱茶均具有較好的抗氧化活性，其中以2016年普洱茶多酚的抗氧化效果最佳。本試驗測得2019年番石榴葉茶水提取的抗氧化活性較強，說明貯藏時間越短，茶葉中多酚的抗氧化活性越強。本試驗還證明番石榴葉茶沖泡時間在30～40 min時，抗氧化活性最強。由于番石榴葉茶中的抗氧化物質前期大量且快速地溶出，而后隨著時間的延長，抗氧化物質發生氧化或者結構發生改變，導致其活性降低。王波等［28］給予糖尿病小鼠番石榴葉水提物，結果表明番石榴葉提取物對小鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶活性具有明顯的抑制作用，并呈現劑量效應關系，本研究同樣測得番石榴葉茶提取物對α-葡萄糖苷酶活性具有較強的抑制作用，且貯藏時間較長的樣品抑制效果較明顯。

4 結論

本試驗比較了兩個年份番石榴葉茶的香氣成分、多酚和多糖含量，探討其抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性。結果表明，番石榴葉茶中的功能性物質在貯藏過程中有所改變，抗氧化活性以及對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相應發生變化；隨著泡茶時間的延長，抗氧化活性呈現先增加后減少的趨勢，最佳泡茶時間為30～45 min。貯藏時間較久的2018年樣品α-葡萄糖苷酶抑制活性優于陽性藥物阿卡波糖，說明番石榴葉茶具有開發成降血糖功能性代用茶的潛質。番石榴葉茶的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性與多酚和多糖的含量有密切關系，其作用機制有待進一步探究。我國華南地區有著豐富的番石榴葉資源，但是利用率較低，本試驗不僅為番石榴葉茶在食品行業的實踐應用奠定了理論基礎，而且為番石榴果樹資源綜合利用提供切實可行的途徑。