玉米細菌性枯萎病菌熒光重組酶介導等溫擴增檢測方法的建立與應用

單長林，周 圓，李孝軍

（舟山海關綜合技術服務中心，浙江 舟山 316021）

【研究意義】玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartiisubsp.stewarii，Pss）是我國進境植物檢疫性病原物之一，主要分布在美國、加拿大、墨西哥、巴西、秘魯、意大利、波蘭、羅馬尼亞、馬來西亞、泰國、越南以及俄羅斯、烏克蘭等原蘇聯國家和地區［1］。盡管我國是僅次于美國的第二大玉米生產國，但隨著國內玉米需求量的激增，未來中國仍需要通過進口來填補玉米產需缺口，玉米凈進口將成為常態［2］。目前玉米進口來源主要集中在烏克蘭、美國等玉米細菌性枯萎病菌發生國家［3］。隨著玉米進口貿易的發展，玉米細菌性枯萎病菌侵入我國風險劇增，該病原物在我國主要玉米產區均適合定殖，具有廣泛的適生區域，一旦入侵將嚴重威脅我國玉米生產安全［4］。因此，建立并掌握針對玉米細菌性枯萎病菌快速檢測技術至關重要。

【前人研究進展】目前，針對玉米細菌性枯萎病菌的檢測主要有傳統的分離培養［5］、血清學檢測［6］、分子生物學檢測［7-8］和紅外光譜檢測［9］，這些方法或操作復雜、耗時較長，或需大型儀器的支持，無法實現體外恒溫條件的快速檢測。與傳統PCR的變性-退火-延伸等熱循環解鏈原理不同，環介導基因恒溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）和重組酶介導等溫擴增技術（recombinase-aided amplification,RAA）均可在恒溫條件下實現目標序列的擴增。LAMP技術［10］在65℃條件下，使用鏈置換型BstDNA聚合酶，利用4～6個引物，通過類似于滾環復制的鏈替換反應產生互補序列，形成大小不一的一系列條帶。LAMP技術是目前體外恒溫擴增檢測病原物主要方法之一，廣泛用于細菌、真菌、病毒等病原物檢測［11-15］。封立平等［11］利用LAMP技術成功建立了針對Pss的快速檢測方法，該方法特異、靈敏且結果可視化。但利用LAMP技術檢測Pss所得產物為大小不等的一系列條帶，無法進行克隆、測序等進一步驗證。而RAA技術［16］則利用重組酶，在單鏈DNA結合蛋白（singlestranded DNA binding,SSB）的幫助下,使模板DNA 解鏈，經DNA聚合酶的作用，恒溫條件下實現目標序列的快速擴增，且產物為單一條帶。

【本研究切入點】參與磷酸代謝的pst操縱子和相鄰的glmS基因區間序列（pstS-glmS序列）在不同菌種間存在明顯差異，可用于Pss菌株鑒定［17-18］。RAA方法具有耗時短、特異性強、靈敏度高等特點，是目前應用于細菌、病毒和支原體等病原微生物恒溫檢測［19-21］研究的熱門方法之一。【擬解決的關鍵問題】本試驗使用熒光重組酶介導等溫擴增技術，以pstS-glmS序列為模板設計引物和探針，以建立在恒溫條件下快速檢測玉米細菌性枯萎病菌的熒光RAA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米樣本為烏克蘭進境飼用玉米，進境口岸為舟山，進境時間為2018—2019年，共計24個樣品，每個樣品2 kg。

供試菌株共計12株，其中玉米細菌性枯萎病菌菌株（Pantoea stewartiisubsp.stewarii,Pss）為ATCC標準菌株（編號ATCC 29229），玉米內州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensissubsp.nebraskensis,Cmn）為ATCC標準菌株（編號ATCC 27794），由杭州海關綜合技術服務中心贈送；丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.syringae,Pssy）、磚紅色微桿菌（Microbacterium testaceum,Mt）、密執安棍狀桿菌詭譎亞種（Clavibacter michiganensissubsp.insidiosus,Cmi）、密執安棍狀桿菌密執安（Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis,Cmm）為本實驗室保存；成團泛 菌（Pantoea agglomeran,Pag）、菠蘿泛菌（Pantoea ananatis,Pan）、分散泛菌（Pantoea dispersa,Pd）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia andropogonis,Ba）、玉米迪克氏菌（Dickeya zeae,Dz）、歐氏桿菌（Erwinia chrysanthemivar.zea,Ecz），購自北京百歐博偉生物技術有限公司。

主要試劑：熒光 RAA 試劑盒（S002ZC）購自杭州眾測生物技術有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒（9763）購自寶生物工程（大連）有限公司，新型植物基因組DNA提取試劑盒（DP320）購自天根生化科技（北京）有限公司，2×TaqPCR StarMix with Loading Dye（A012）購自GenStar-康潤生物。主要儀器：熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.2 試驗方法

1.2.1細菌菌株準備、基因組提取 在NA平板劃線，28 ℃培養48 h，接種環刮板收集菌株。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組，用微量分光光度計（Nanodrop 2000）驗證提取效果。-20 ℃保存備用。

1.2.2目標片段獲取、引物探針設計 以Pss全基因組序列（Gen Bank登錄號：CP 017581）為靶標，設計擴增pstS-glmS靶標序列引物pss3/pss4，分別對應基因組444415 nt和444914 nt，擴增靶標序列。PCR反應體系（50 μL）：2×TaqPCR StarMix with Loading Dye 25 μL，pss3/pss4 （10 μmol/L）各 2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳割膠回收，進行克隆測序。

以測序獲取序列片段（圖1）為模板，按照RAA引物、探針設計原則，設計正向引物F1、F2、F3、F4、反向引物R1、R2、R3和探針P，BLAST分析驗證引物、探針特異性。以上引物、探針序列信息見表1、圖1。本試驗目的序列克隆測序，引物、探針的合成均由生物工程技術（上海）有限公司完成。

表1 實驗用引物和探針Table 1 Primers and probe sequences used in this experiment

1.2.3引物篩選與體系建立 采用商品化熒光RAA試劑盒，并利用熒光定量PCR儀進行熒光RAA實驗。按照方法1.2.1 提取Pss DNA（280 ng/μL），以無菌ddH2O進行10倍等梯度稀釋，梯度濃度分別為280、28、2.8、2.8×10-1、2.8×10-2、2.8×10-3、2.8×10-4、2.8×10-5ng/μL。以不同濃度的Pss DNA為模板，選取F1/R1引物組合，初步探索熒光RAA最低檢測濃度。

以Pss最低檢測濃度DNA為模板，分別探索不同引物組合F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2/R3、F3/R1、F3/R2、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3對Pss的熒光RAA檢測效果，篩選出擴增效率最高的引物組合。反應體系采用試劑盒說明書推薦體系（50 μL）：A Buffer 40.9 μL，B Buffer 2.5 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，熒光探針（10 μmol/L）0.6 μL，DNA模板2.0 μL；擴增程序為39 ℃30 s，共40個循環。

1.2.4靈敏度測定及特異性驗證 參照1.2.3試驗結果，合理選取不同濃度的Pss DNA樣本，并利用篩選出的最佳引物組合，測定建立熒光RAA檢測方法的靈敏度。

熒光RAA特異性檢測分別以3株泛菌屬其他菌株（Pan、Pag、Pd）及8株病原細菌（Cmn、Pssy、Mt、Cmi、Cmm、Ba、Dz、Ecz）DNA為 參考模板進行驗證。

1.2.5熒光RAA檢測玉米樣本的應用 將1.2.1收集的菌體，用無菌 ddH2O制備菌懸液，采用涂板法測定菌懸液濃度（3.5×103CFU/mL）。選取鑒定結果為陰性的進境飼用玉米（實驗室編號1-3103304），磨成粉末狀，每份10 g，共6份，分別加入濃度為3.5×103CFU/mL的Pss菌液，攪拌混勻，制備陽性模擬玉米樣本。利用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取模擬樣本與真實玉米樣本DNA，進行熒光RAA檢測。同時以標準 SN/T 1375-2004：玉米細菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法復核驗證。

2 結果與分析

2.1 引物和探針序列分析

利用BLAST與全數據庫序列比對，分析實驗中設計的引物，結果顯示：實驗設計所有引物組合，包 括pss3/pss4、F1/R1、F1/R2、F1/R3、F2/R1、F2/R2、F2/R3、F3/R1、F3/R2、F3/R3、F4/R1、F4/R2、F4/R3對Pss菌株DC283（登錄號：CP017581）、ZJ-FGZX1（登錄號：CP049115）的識別率和覆蓋率均為100%，對數據庫其他序列沒有明顯識別現象；探針P對Pss菌株DC283（登錄號：CP017581）、菌株ICMP275pstS-glmS序列（登錄號：AB894430）的識別率為100%，菌株ZJFGZX1（登錄號：CP049115）識別率為97.87%，對數據庫其他序列無識別現象。

2.2 引物篩選與體系建立

以Pss梯度稀釋DNA為模板，探索引物組合F1/R1的熒光RAA最低檢測濃度，結果見圖2A。濃度為2.8、2.8×10-1、2.8×10-2、2.8×10-3ng/μL的DNA模板進行熒光RAA檢測，均具有明顯的擴增曲線，濃度為2.8×10-4ng/μL的DNA則沒有典型的擴增曲線。故引物組合F1/R1的熒光RAA最低檢測濃度為2.8×10-3ng/μL。本實驗以2.8×10-3ng/μL DNA為模板進行不同引物組合擴增效果實驗。

圖3A、B、C顯示的是以2.8×10-3ng/μL DNA為模板，反向引物R1、R2、R3分別與正向引物F1、F2、F3、F4組合的熒光RAA擴增曲線。結果顯示，每種組合均能收集到擴增曲線，但引物組合F1/R2與F4/R2在相同反應循環數下，相對熒光強度均高于其他引物組合，擴增效率明顯高于其他引物組合。不同引物組合熒光RAA 經40個循環收集到的相對熒光強度（?Rn）大小依次 為F1/R2＞ F4/R2＞ 250 000＞F1R1/＞ F4/R1＞150 000＞ F3/R1＞ F2/R1＞F3/R2＞100 000＞ F2/R2 ＞F1/R3＞ F4/R3＞50 000＞ F3/R3＞ F2/R3。比較引物組合F1/R2和F4/R2，在38個循環前引物組合擴增效率F4/R2＞ F1/R2，但在38個循環后F1/R2擴增效率明顯高于F4/R2。經多次重復，最終選定引物組合F1/R2為玉米細菌性枯萎病菌熒光RAA檢測最佳引物組合。

2.3 靈敏性及特異性測定

參照2.2中引物組合 F1/R1的熒光RAA最低檢測濃度為2.8×10-3ng/μL（圖2A），本實驗選取濃度為2.8×10-2、2.8×10-3、2.8×10-4及2.8×10-5ng/μL的玉米細菌性枯萎病菌DNA樣本，進行引物組合F1/R2熒光RAA靈敏度測定，結果見圖2B。濃度為2.8×10-2、2.8×10-3和2.8×10-4ng/μL的樣本均呈現明顯擴增曲線，濃度為2.8×10-5ng/μL的樣本無明顯擴增現象。因此，以引物組合F1/R2建立的熒光RAA檢測方法的靈敏度為2.8×10-4ng/μL（280 fg/μL），比引物F1/R1組合的熒光RAA靈敏度提高10倍。

特異性驗證實驗選取3株泛菌屬其他菌株及8株病原細菌DNA為參考模板，以不同濃度的Pss DNA（編 號Pss-1：280 ng/μL；Pss-2：2.8×10-4ng/μL）為陽性對照，無菌ddH2O為陰性對照，驗證建立的熒光RAA檢測體系的特異性，結果見圖4，玉米細菌性枯萎病菌DNA樣品Pss-1、Pss-2均具有明顯擴增曲線，包括3株泛菌屬Pag、Pan、Pd基因組在內的其他11株參照DNA模板均沒有擴增現象，表明以引物F1/R2和探針P組合的熒光RAA檢測體系可以特異檢出Pss。

2.4 模擬樣本及真實樣品檢測效果

利用新型植物DNA提取試劑盒，提取進境玉米樣本和模擬玉米樣本DNA。使用建立的熒光RAA檢測方法和SN/T 1375-2004標準方法同時進行Pss檢測，結果利用熒光RAA檢測方法檢出6份模擬玉米樣本，未檢出24份真實玉米樣本，檢測結果與SN/T 1375-2004方法一致，準確率100%。證實新建立的熒光RAA檢測方法可針對玉米種子樣本進行玉米細菌性枯萎病菌的檢測。

3 討論

RAA技術具有靈敏、特異、簡便和快速的優點，可實現常溫下對目的序列的指數級擴增。目前針對RAA引物、探針設計，主要要求引物長度在30～35 nt之間，序列中無回文結構、連續單堿基重復序列和二級結構，暫無針對引物與重組酶蛋白結合方面的設計要求。本實驗中以玉米細菌性枯萎病菌pstS-glmS特異性序列為模板，設計4條正向引物和3條反向引物，盡管12組引物對都能實現擴增，但分析熒光RAA經40個循環收集的相對熒光強度（?Rn），擴增效率差異很大。同一反向引物中，與正向引物F1、F4組合擴增效率明顯高于與引物F2、F3組合擴增效率；與F1、F4組合的反向引物R1、R2、R3中，R2組合擴增效率明顯高于R1、R3。究其原因，應是引物與重組酶蛋白結合效率存在差異，正向引物F1、F4與重組酶蛋白結合效率比F2、F3高，反向引物R2與重組酶蛋白結合效率比R1、R3高。因此，有必要進一步研究RAA中引物與重組酶蛋白之間的結合機制，以期指導引物的設計，提高效率。

分子生物學檢測是目前實驗室進行植物病原菌檢測的重要手段，而靶標序列的選擇則是實現特異性檢測的關鍵所在。目前針對玉米細菌性枯萎病菌進行的分子生物學檢測，選取的靶標序列主要有16S-23S序列、16S序列［7］、cpsD基因序列［8］和pstS-glmS序列［18］。依據16S-23S序列篩選特異性引物制定的標準SN/T 3756-2013：玉米細菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法PCR方法，因已被證實引物序列無法區分Pss和Pantoea stewartiisubsp.indologenes（Psi），于2019年12月31日廢止（海關總署公告2019年第231號）。王贏等［7］利用16S序列成功設計了玉米細菌性枯萎病菌特異性引物Ps2r/Ps3r，并對部分文獻中設計的引物序列進行特異性驗證，發現包括DEP1/DEP2、CPSL1/CPSL2c在內的多對依靠16S序列和cps基因序列設計的引物均無法區分Pss和Psi。Gehring 等［17］和Wensing 等［18］通過序列分析證實pstS-glmS序列在不同菌種間存在明顯差異，可以區分Pss和Psi，用于Pss菌株鑒定。本實驗利用pstS-glmS序列為靶標序列，設計引物和探針，通過BLAST與全庫數據序列分析和參考菌株特異性檢測實驗，證實引物探針的特異性，成功建立了針對玉米細菌性枯萎病菌的熒光RAA檢測方法。

新建立的以引物F1/R2和熒光探針P為組合的熒光RAA檢測方法，實現了針對玉米細菌性枯萎病菌的特異性擴增，靈敏度高達280 fg/μL，與實時熒光PCR方法［8］相比，熒光RAA靈敏度有所提升（Tambong等建立的TaqMan實時熒光法靈敏度為1 pg），且檢測可利用小型儀器—熒光測試儀在恒溫條件下完成反應，不需要大型儀器支持；與酶聯免疫試紙條法檢測玉米細菌性枯萎病菌［6］相比，僅需20 min就可完成反應，不需要在4 ℃條件下0.9% NaCl過夜孵育，節省檢測時間；與LAMP技術用于檢測玉米細菌性枯萎病菌［11］相比，因為其擴增產物為單一條帶，而不是大小不等的一系列片段，可用于后續的克隆、測序等進一步驗證，也可實時監控擴增情況，為后續定量研究奠定基礎。

4 結論

本研究針對玉米細菌性枯萎病菌特異性pstS-glmS序列片段，參照RAA原理設計引物和探針，并通過引物篩選、特異性驗證和靈敏性測定等實驗，成功建立了玉米細菌性枯萎病菌熒光RAA檢測方法。該方法可在20 min內，特異性地完成玉米細菌性枯萎病菌的檢測，靈敏度高達280 fg/μL，且通過了玉米真實樣本與玉米模擬樣本檢測驗證，為玉米細菌性枯萎病菌的快速檢測提供了新的方法選擇。