基于SSR標記的廣東含笑等11個含笑屬物種親緣關系研究

徐 放，朱報著，潘 文，朱政財，鐘乃盛，李文業，趙強民

（1.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業科學研究院，廣東 廣州 510520；2.廣州市增城區林業和園林科學研究所，廣東 廣州 511300；3.棕櫚生態城鎮發展股份有限公司，廣東 廣州 510627）

【研究意義】木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（MicheliaL.）有80余種植物，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區。該屬樹種樹型優美、香氣怡人，被廣泛應用于園林綠化中，且兼具材用、藥用和油脂用等用途，具有廣闊的應用前景［1-5］。含笑屬種間生殖隔離較弱，表型變異豐富，部分植物的分類和親緣關系在學術界仍有爭議［6］，急需在含笑屬中開展親緣關系研究，明晰各種間遺傳關系，為后續開展種間雜交和優良新品種選育提供有力的指導。【前人研究進展】隨著分子標記技術的發展，分子標記已經在含笑屬植物遺傳多樣性和親緣關系研究中得到應用。王艇等［7］首次利用RAPD標記開展了含笑屬中4個含笑亞屬的系統發育研究。王亞玲等［8］利用trnL內含子及trnL-trnF間隔區序列對多個含笑屬植物進行了親緣關系分析，發現其中一個簡單重復序列的插入可以作為系統發育分析的依據之一。滕花景［9］篩選了19個RAPD標記對樂昌含笑（Michelia chapensis）6個群體進行聚類分析。柴弋霞［10］開發ISSR標記對紫花含笑（M.crassipes）及其與近緣種的雜交子代進行了親緣關系分析，發現子代分子標記分型結果與形態學標記一致。李劍等［11］將AFLP和ISSR標記共同用于含笑屬植物的親緣關系分析，初步得出7種進化歷程。王猛等［12］利用10個ISSR分子標記對云南省內的48種野生木蘭科植物進行親緣關系初步分析，并劃分為7個類群，其中含笑屬17個種被劃分到6個不同類群中，該研究發現基于分子標記的聚類結果與傳統分類學存在一定的差異。溫強等［13］利用ISSR標記對3個墨紫含笑新品種和4個近緣種進行了親緣關系的評價。【本研究切入點】目前本研究供試的廣東含笑等11個含笑屬物種表型多樣，親緣關系尚不清楚，急需通過穩定的分子標記對不同物種進行基因分型和親緣關系分析。【擬解決的關鍵問題】本研究在收集含笑屬資源的基礎上，利用基于M13熒光標記的12對SSR引物獲取11個含笑屬物種的基因型，并對不同物種的親緣關系進行分析，計算不同物種間的遺傳距離，旨在建立一個高效的含笑屬植物的基因分型體系，為含笑屬的保護和開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與DNA提取

供試的11個含笑屬物種采自廣東省林業科學研究院種質資源圃（表1），分別編號M01～M11，采集生長良好的葉片，液氮速凍后放入-80℃超低溫冰箱保存。選用0.2～0.3 g葉片利用震蕩研磨儀破碎，采用改良CTAB法［14］進行DNA提取，利用Nanodrop2000（Thermo，美國）核酸檢測儀檢測DNA濃度，稀釋至50 ng/μL備用。

1.2 引物篩選

參照Sun等［15］和李紅英等［16］論文中的引物信息合成40對引物，稀釋至10 μmol/L備用，選擇11個物種的DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為20 μL，包含DNA模板2 μL、正反引物各0.4 μL、PCR Mix（上海生工，上海）10 μL和ddH2O 7.2 μL。擴增反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸5 min。產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。選取擴增成功率90%以上的引物共計12對，用于后續試驗以獲取各物種的基因型。

1.3 基因分型體系建立

選用基于M13序列的熒光標記方法獲取基因型［17］，在M13序 列TGTAAAACGACGGCCAGT的3′端分別添加6-FAM、HEX、TAMRA和ROX作為熒光標記引物，12個標記的正引物進行重新合成，在正引物3′端添加M13序列，其序列見表2。基因分型PCR反應體系為20 μL，包含DNA模板2 μL、M13標記0.4 μL、正引物0.15 μL、反引物0.4 μL、PCR Mix 10 μL和ddH2O 7.05 μL。擴增反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s，30個循環；94℃變性40 s、53℃退火45 s、72℃延伸45 s，8個循環；72℃延伸5 min。產物利用ABI3730測序儀進行毛細管電泳檢測，使用LIZ-500作為內標。

表2 基因分型使用的引物信息Table 2 Primer information in the genotyping experiment

1.4 數據分析

利用GeneMarker v 2.05軟件［18］對基因分型的結果進行判讀，獲取原始片段長度數據后，利用Excel的宏文件Flexibin進行數據整理。利用GenAlex6.5［19］計算等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、Shannon多樣性指數（I）和表觀雜合度（Ho）。利用Cervus［20］計算多態性信息含量（PIC）。獲取各物種的基因型數據后，利用DARwin軟件［21］進行不同物種間的親緣關系分析，構建基于非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的Neighbor-Joining（NJ）聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物的種間通用性

利用40對引物對11個物種進行擴增的結果顯示，不同引物擴增成功率在40%～100%之間，總體擴增成功率為66.5%。2%瓊脂糖電泳顯示無非特異產物的引物共計12對，PCR產物片段長度均在350 bp以下（圖1），其中5對引物可以在全部11個物種中高效擴增（表3），12對引物擴增成功率從72.7%～100%不等、平均為90.9%，以上12對引物用于本研究的后續試驗。

2.2 遺傳多樣性分析

獲取11個物種的基因型后開展遺傳多樣性分析，結果見表4。位點LT106擴增獲得的等位基因數最多、為12個，位點LT47擴增獲得的等位基因數最少、僅4個。12個標記的有效等位基因數的變化范圍為2.909～10.083；Shannon多樣性指數（I）為1.303～2.437；觀測雜合度（Ho）最小為0、最大為0.818；期望雜合度（He）變化區間為0.656～0.901，多態信息含量（PIC）為0.671～0.880。

2.3 11個含笑屬物種的親緣關系分析

DARwin軟件獲得的NJ聚類圖如圖2所示，由圖2可知，11個物種被劃分成3個不同的重要分支，其中第一分支的物種為廣東含笑（M.guangdongensis）、金葉含笑（M.foveolata）、醉香含笑（M.macclurei）、石碌含笑（M.shiluensis）和苦梓含笑（M.balansae）；第二分支包括2個物種，分別為深山含笑（M.Maudiae）和含笑（M.f igo）；第三個分支的4個物種為白蘭（M.alba）、黃蘭（M.champaca）、紫花含笑（M.crassipes）和樂昌含笑（M.chapensis）。第一分支和第二分支上的7個物種均屬于后生含笑亞屬，而第三個分支上的4個物種中，樂昌含笑屬于后生含笑亞屬，另外3個物種屬于含笑亞屬。

3 討論

SSR標記廣泛分布于真核生物的基因組中，作為共顯性標記，相比于傳統的RADP、ISSR和AFLP等顯性標記類型，可以更準確地獲得生物遺傳信息。由于SSR標記具有高度變異、操作簡單、重復性好、準確率高等優點，因此可以作為物種分類、種質資源評價、雜交親本選擇等遺傳分析的重要工具。李清瑩［22］在醉香含笑中開發了SSR標記，并對醉香含笑的種質資源進行了遺傳多樣性研究，結合生長表型評選出優良種源和家系。鄭紀偉等［6］利用13個SSR標記對8種含笑進行了種質指紋圖譜的構建。另外，在木蘭科鵝掌楸（Liriodendron chinense）［23-25］中分別進行了SSR引物開發和雜交種判別和自然條件下物種漸滲等研究，為鵝掌楸的新品種選育提供了重要指導。以上研究均表明SSR標記可在遺傳分析中獲得良好效果。本研究中選用的SSR標記多態性好，平均PIC值達到0.769，擴增成功率較高、達90.9%，且100%位點具有多態性，相比于近年來前人在十字花科（Brassicaceae）［26］、榛屬（Corylus）［27］和玉葉金花屬（Mussaenda）［28］中的親緣關系分析研究，本研究中引物擴增成功率和多態性均有顯著提升，以上數據表明應用該12組引物可以較為準確地反映試驗材料的遺傳信息，可以作為后續雜交親本篩選和雜交子代判定的重要工具。本研究中選用了經濟性較好的基于M13序列的熒光標記方法，相比于傳統的聚丙烯酰胺（PAGE）檢測，可顯著提升實驗效率，并實現了試驗結果的數字化讀取，避免了人工讀取造成的較大誤差。另外，與在正引物的3′端直接進行熒光標記的試驗方法相比，本試驗中采用的方法可以使總體試驗成本降低40%以上。

表3 各標記在11個含笑屬物種中的擴增成功情況Table 3 Successful amplification of SSR markers in 11 Michelia species

表4 11個含笑屬物種的遺傳多樣性信息Table 4 Genetic diversity information of 11 Michelia species

木蘭科中屬種的劃分，因不同物種的性狀相似性較高，一直是分類學家爭論的熱點，而含笑屬的系統分類更是爭論的焦點［3］。含笑屬植物在屬下等級的劃分經歷了較長的發展歷史，但仍存在較大分歧，目前主要有劉玉壺［29］及Chen等［30］提出的兩套不同分類系統。本研究將11個含笑屬物種進行了聚類，其中廣東含笑、金葉含笑和醉香含笑的親緣關系較近，Yan等［31］于2004年首次報道該物種時，根據其葉片、花瓣和花蕊形態和發現地的地理環境等，認為廣東含笑與金葉含笑和醉香含笑的親緣關系最為接近，有可能為自然條件下二者的變種或雜交種，本研究支持了相關結論。另外，本研究可以將11個物種分屬兩個亞屬的差異體現出來，證明本研究開發的基因分型體系準確性較高。目前，含笑屬新品種的雜交選育研究逐步興起，如中南林業科技大學通過種間雜交獲得多個含笑的新品種，并獲得國家林業局的新品種授權［32］。王晶等［33］利用金葉含笑和廣東含笑進行雜交，選育出矮化、多花且花色特異的新品種。隨著含笑屬物種和新品種的逐漸增加，為了更加準確地進行含笑屬物種的分類和親本溯源，可以使用本研究開發的分子標記，結合形態學、細胞生物學等多種方法進行分析，從而進行更加準確的親緣關系劃分，為后續的含笑屬植物保護和利用提供有力指導。

4 結論

利用SSR標記進行含笑屬親緣關系的研究，有助于開展后續的物種利用和保護工作。本研究利用12對高多態性引物構建了11個含笑屬物種的基因分型體系，分析了不同物種間的親緣關系，構建了Neighbor-Joining進化樹，結果表明廣東含笑、金葉含笑、醉香含笑、石碌含笑和苦梓含笑的親緣關系較近，深山含笑和含笑的遺傳距離較近，樂昌含笑與屬于含笑亞屬的白蘭、黃蘭和紫花含笑遺傳關系較為緊密。