銫-137γ射線輻射對郁金香鱗莖的誘變效應

黑銀秀，劉君，郭方其，江景勇

（1.臺州市農業科學研究院，浙江 臺州 3170002；2.浙江省農業科學院 園藝所，浙江 杭州 310021）

郁金香Tulipa gesneriana是百合科Liliaceae郁金香屬Tulipa多年生鱗莖植物，是世界著名的球根花卉。近年來，國內的一些植物園和花海展區從荷蘭進口的郁金香商品種球的品種和數量在逐年增多[1-3]，種球嚴重依賴國外進口。輻射誘變育種具有變異頻率高、變異幅度大、育種周期短等特點，是當前無性繁殖植物育種的主要方法之一。全世界采用該技術已在營養繁殖植物中育出465個突變品種，其中，大多數是花卉植物，包括菊花Chrysanthemum × morifolium、大麗花Dahlia pinnata、玫瑰Rosa rugosa等[4]。γ射線輻射誘變技術在我國花卉育種中已取得顯著成果，菊花[5-6]、月季的誘變新品種在所有觀賞植物中首屈一指[7]。另外，水仙Narcissus tazettavar.chinensis.[8]、唐菖蒲Gladiolus hybridus[9-10]、蓮Nelumbo nucifera[11]、香雪蘭Freesia refracta、王百合Lilium regale[12]等多種花卉經輻射后均獲得了突變品種。早在上個世紀80年代，荷蘭De Mol等首先進行了郁金香輻射育種研究[13]，許多受歡迎的郁金香品種，如‘Murillo’‘William c opland’‘Bartigon’等就是通過突變的方法選育出來的[14]。近十余年來，國內關于郁金香的研究主要集中在郁金香的引種與栽培[15-16]、低溫處理與花期調控[17-18]、鱗莖發育和再利用[19-20]、雜交育種[21-22]等方面。為研究輻射對郁金香鱗莖的誘變效應，本研究以郁金香鱗莖為供試材料，探討了銫-137γ射線不同輻射劑量對鱗莖的花芽分化、出苗率、蕾期及開花性狀的影響，確定了輻射的半致死劑量，以期為郁金香輻射誘變育種適宜劑量的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

2018年6月至2019年4月，在浙江省農業科學院作物與核技術利用研究所進行輻射處理，在臺州市農業科學研究院基地進行栽培和結果調查。

1.2 試驗方法

本文在前期預試驗中用銫-137γ射線40 ～100 Gy進行郁金香花芽分化期輻射試驗，結果發現所有經輻射處理的種球在冷藏期鱗莖根盤均沒有突起跡象，播種1周后沒有發根，播種2周后芽仍未出土，后期鱗莖全部腐爛死亡，而對照（無輻射處理）的生根、出苗、開花則表現正常，說明40 G y已經遠遠超過了郁金香花芽分化期鱗莖的致死劑量。因此，本次試驗選擇5～30 Gy進行試驗。

供試郁金香鱗莖于2018年3月在臺州市黃巖區藍美莊園基地收獲；試驗品種有‘紅牌’‘Red Label’、‘楊范內斯’‘Jan van nes’、‘白雪公主’‘Royal virgin’；鱗莖大小：周徑大于10 cm；輻射時期：2018年6月5日（花芽分化前）；輻射源：銫-137(137Cs) γ射線；劑量率：1 Gy·min-1。試驗每個品種設置5個處理：0 Gy(CK)、5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy，每個處理3次重復，每個重復鱗莖數量為100個。

1.3 鱗莖儲藏方法

2018年4-8月，控制儲藏室溫度不高于22℃、相對濕度在65%±2%；9-11月，溫度為5±0.5℃。6月5日進行輻射處理，輻射處理后，種球仍放回儲藏室，每月取樣1次，每次每個處理取樣3個鱗莖進行解剖。

1.4 田間栽培方法

于2018年12月1日低溫處理完成后，挑選無病蟲害的鱗莖，種植于溫室中，調查統計輻射后各處理鱗莖的生根、出芽及開花情況。

1.5 指標測定方法

芽長：將鱗莖外層鱗片剝掉，露出中心芽體，用游標卡尺測量中心芽體的長，取平均值。

鱗莖生長點切片方法：將鱗莖外層鱗片剝掉，露出中心芽體，對生長點進行切片，在立體顯微鏡下觀察花芽的分化情況并拍照。

田間地栽試驗采用計數法和直尺測量法。

1.6 數據處理

試驗數據采用Excel和SPSS軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 輻射對郁金香鱗莖中心芽體生長的影響

由圖 1表明，‘紅牌’ 和‘楊范內斯’兩個品種的鱗莖經輻射處理后其中心芽的生長均受到抑制，生長變緩。隨著鱗莖儲藏時間的延長，中心芽逐漸伸長；隨著輻射劑量的增大，中心芽的芽長越小，被抑制作用越明顯。兩個品種不同輻射處理鱗莖中心芽的生長趨勢相同。由圖2可看出，和CK相比，5～30 Gy輻射處理明顯抑制郁金香鱗莖中心芽的生長，輻射劑量越大，抑制作用越明顯。

圖1 輻射對中心芽生長的影響Figure 1 Effect of radiation on the growth of central buds of different cultivars

2.2 輻射對郁金香花芽分化的影響

2.2.1 輻射對‘紅牌’花芽分化的影響 輻射后5個月對‘紅牌’中心芽體切片進行觀察，結果見圖 3。由圖3 可知，CK的花器官結構發育完整，可明顯看到3個外輪花瓣、3個內輪花瓣、6個雄蕊及三棱形的雌蕊，且每個花藥具4個花粉囊，花粉囊呈圓形且明顯鼓起。花藥橫截面面積越來越大，截止到11月29日花藥的橫截面面積與柱頭橫截面面積接近。說明CK的花芽分化整個階段已經完成。10 Gy、20 Gy、30 Gy處理花芽分化速度遲緩，花藥還未形成明顯的4個花粉囊，且單個花藥的橫截面面積明顯小于柱頭的橫截面面積。其中，5 Gy處理花瓣結構發育完整，雄蕊雖然有6個花藥，但其中兩個花藥僅有2個花粉囊（圖3A）。20 G y處理花芽分化進度遲緩，6個雄蕊的花藥四角開始突起（圖3C），未分化為花粉囊，推斷該處理的花芽分化停止在雄蕊分化期。和CK相比，30 Gy處理雄蕊缺少一個，分化停滯在腎形階段，花瓣數目為5個，雌蕊畸形未形成三棱形（圖3D）。

2.2.2 輻射對‘楊范內斯’花芽分化的影響 8月1日對‘楊范內斯’鱗莖進行切片拍照觀察，發現此時CK已經完成整個花芽分化進程（圖4A，圖4B），和‘紅牌’CK的形態相似。

圖2 不同輻射劑量對郁金香鱗莖中心芽長的影響Figure 2 Effect of different radiation dose on length of central bud of ‘Red Label’

由圖4可以看出，5 Gy處理的鱗莖花芽分化整個階段已經完成，出現花藥個別花粉囊缺失（圖4C），柱頭四棱柱等現象（圖4D）。10 Gy處理的鱗莖柱頭呈現不規則形狀，雄蕊畸形，花粉囊缺失較多（圖4E）。20 Gy處理的鱗莖花芽分化進度遲緩，雄蕊與雌蕊未完全分開，6個雄蕊呈現橢圓形或者腎形，未形成 4個花粉囊，花瓣呈短粗狀停滯分化。推斷20 Gy處理的花芽形態分化停滯在花瓣分化期（圖4F）。30 Gy處理的鱗莖花芽分化嚴重遲緩，花瓣形態短粗、結構不完整，雄蕊呈現腎形、未形成4個花粉囊（圖4G），從縱切面可以看到生長錐的基部周圍有幾個雄蕊原基小突起（圖4H）。推斷30 Gy處理的鱗莖花芽形態分化在花瓣分化期已經停滯。

圖3 輻射對‘紅牌’花芽分化的影響Figure 3 Effect of radiation on flower bud differentiation of ‘Red Label’

圖4 輻射對‘楊范內斯’花芽分化的影響Figure 4 Effect of different radiation dose on flower bud differentiation of ‘Jan van nes’

2.3 輻射對郁金香鱗莖出苗率的影響

由表1表明，隨著輻射劑量的增大，3個品種的出苗率均呈現逐漸降低的趨勢，輻射劑量越高，死亡率越高。不同品種對輻射的敏感度不同，其中，‘白雪公主’對銫-137γ射線的輻射較敏感，輻射劑量為10 Gy時，出苗率只有2.67%；‘紅牌’耐輻射的能力最強，5 Gy處理出苗率仍高達91.45%。

表1 輻射對不同郁金香品種出苗率的影響Table 1 Effect of different radiation dose on the emergence rate of different cultivars of tulip

3個品種鱗莖經5 Gy輻射處理后的出苗率均在60%以上，而10 Gy處理的出苗率均降至30%以下。說明，對3個品種花芽分化期的鱗莖進行輻射誘導，半致死劑量在5～10 Gy之間。

2.4 輻射對郁金香蕾期的影響

‘紅牌’鱗莖5 Gy輻射處理，蕾期花瓣邊緣出現明顯裂刻，葉片邊緣開裂（圖5A）；10 Gy處理，蕾期植株矮小、葉片開裂、花葶不抽出（圖5B）。‘楊范內斯’鱗莖10 Gy處理，蕾期植株矮縮，花葶不抽出，葉片變窄、細長或畸形（圖5C）；10 Gy處理，蕾期植株矮小、葉片變窄、花瓣和花絲缺失、柱頭畸形（圖5D）。

2.5 輻射對郁金香開花性狀的影響

‘紅牌’鱗莖經5 Gy處理的開花率達到80%，已開花植株花瓣全部出現不同程度的裂刻；經10 Gy處理的花瓣裂刻加深，花瓣顏色不均勻（圖6）。由圖7可以看出，和CK（I）相比，‘白雪公主’鱗莖經5 Gy輻射之后的開花性狀產生明顯變異。主要變化為：有的植株花瓣出現紅色條紋（B、C、D）、有的半個花瓣變為紅色（A），雄蕊由正常的6個變為7或者更多（E、G、H），雌蕊由正常的三棱柱變為4開裂（G）、5開裂（E）或不規則畸形（F），花瓣上有殘留的雄蕊（F）、花瓣邊緣出現深淺不一的開裂（F、G、H）。

圖5 輻射對郁金香蕾期的影響Figure 5 Effect of different radiation dose on flower bud stage of‘Red Label’ and ‘Jan van nes’

圖6 輻射對‘紅牌’開花性狀的影響Figure 6 Effect of different radiation dose on flowering traits of ‘Red Label’

圖7 5 Gy輻射對‘白雪公主’開花性狀的影響Figure 7 Effect of 5 Gy radiation on flowering traits of ‘Royal virgin’

3 結論

本研究對不同輻射劑量處理郁金香鱗莖進行切片，觀察輻射對其花芽分化形態的影響，并進行田間栽培，在苗期、蕾期、花期進行了形態學觀察。不同劑量的輻射處理對郁金香不同時期的影響程度也不相同，發生顯著性變異的較多。試驗結果表明，大于5 Gy輻射處理能顯著抑制鱗莖中心芽的生長，且輻射劑量越大，抑制作用越明顯。儲藏期間對中心芽體進行切片觀察發現，輻射劑量越大，花芽分化受到的影響越大、分化進度越慢。和CK相比，5 Gy處理的鱗莖已完成花芽分化且花結構基本完整，10～30 Gy輻射處理的出現了花芽分化停滯、花瓣短粗或停滯分化、雄蕊為分化早期的腎形、花藥四角剛開始凸起、花粉囊缺失、柱頭呈現四棱形或者畸形等不同突變狀態。

在輻射育種中選擇適宜劑量和劑量率是提高誘變效率的重要因素[23]。由本試驗苗期觀察發現，‘白雪公主’對銫-137γ射線的輻射較敏感，而‘紅牌’耐輻射的能力相對較強。隨著0～30 Gy輻射劑量的增大，不同品種均呈現輻射劑量越高，死亡率越高，出苗率越低。20 Gy和30 Gy處理的出苗率為0%。3個品種50%的出苗率均發生在處理5～10 Gy之間，由此可初步推斷花芽分化期郁金香的輻射半致死劑量在5～10 Gy。由蕾期和花期的調查結果表明，輻射劑量越大變異效應越顯著，其主要變異有植株矮小、長勢緩慢、葉片開裂或畸形、花瓣變異或缺失、花葶不抽出、雌蕊和雄蕊缺失增多或畸形等。5 Gy處理的花瓣邊緣出現不同程度的裂刻，是篩選變異品種的合適劑量。

4 討論

張繼娜[24]和汪曉謙[25]將郁金香的花芽分化分為未分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期，其中，在雌蕊分化期可明顯看到在花芽原基的頂端形成三棱形的雌蕊[26]，據此推斷出本研究中CK和5 Gy處理的鱗莖已完成花芽分化的整個階段，而10～30 Gy處理的鱗莖花芽分化進度緩慢甚至停滯。

輻射誘變育種是利用γ射線等誘發植物基因和染色體畸變，獲得有價值的突變體，從而育成優良品種[27]。本研究中，5 Gy處理的鱗莖出苗率在50%以上，能夠完成花芽分化進程，且開花性狀產生了一些變異，比如花瓣邊緣出現裂刻、花色變異等，說明5 Gy處理有利于得到更多的花部變異，是篩選變異品種的合適劑量。前人對百合L.brownievar.viridulum鱗莖進行輻射，從不定芽植株的突變率考慮，輻射誘發變異的適合劑量是1～3 Gy[28]。該劑量和本研究結果比較接近，百合和與郁金香同屬一科，可見他們對輻射劑量的敏感度也比較接近。

輻射誘變育種中常用的γ射線輻射源是鈷-60、銫-137及核反應推[23]。花卉研究中利用鈷-60γ射線的較多，而選用銫-137γ射線的極少。本文研究結果表明銫-137γ射線同樣可以達到輻射變異效果。需要注意的事項是，植物組織器官發育階段和生理狀態不同，對輻射的敏感性存在很大的差異[23]，因此，本文選擇花芽分化前且周徑大于10 cm的鱗莖進行輻射，這樣可以保證當年觀測到花部的輻射效果。