雷公藤甲素減輕MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷的作用機制研究

段然，吳沅皞，劉維

（天津中醫藥大學第一附屬醫院 風濕免疫科，天津300193）

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是臨床常見的自身免疫性疾病，以自身免疫應答紊亂、產生自身抗體異常并與相應自身抗原形成免疫復合物為特征，可累及全身多個臟器并引起相應的臨床表現[1]。腎臟是SLE 病情發展變化過程中常見的受累臟器，免疫復合物在腎臟沉積后引起狼瘡腎炎（lupus nephritis,LN），LN 不僅是影響SLE 預后的重要因素，也是引起終末期腎臟病的常見原因，需要進行積極防治[2-3]。雷公藤甲素（Triptolide,TPL）是從中藥雷公藤中提取到的環氧化二萜內酯化合物，具有免疫調節活性，在SLE、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的治療中體現出一定價值[4]，多項研究報道了TPL 對SLE 小鼠腎功能的保護作用[5-6]，但具體的機制并未闡明。國內施棟梁等[7]關于SLE 的細胞實驗證實，TPL 對γ 干擾素（Interferon-gamma,IFN-γ）誘導的腎小球細胞炎癥具有緩解作用，且這一作用與抑制JAK1/STAT1 信號通路有關。基于此，本實驗深入探究TPL 調控JAK1/STAT1 通路，減輕MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷的作用及機制，旨在闡明TPL 用于LN防治的潛在價值及分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL/6 正常小鼠8 只及MRL/lpr 狼瘡小鼠32 只購自蘇州賽業模式生物研究中心，8～10 周齡、體重20～25 g。實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0003。

1.2 實驗試劑與儀器

TPL 購自上海柘智生物科技公司，過表達JAK1 的腺病毒購自上海漢恒生物科技公司（濃度1×1011PFU/ml、-80℃保存），尿蛋白、血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea,BUN）檢測試劑盒購自南京建成研究所，免疫熒光染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，IgG、C3 抗體購自美國Abcam 公司，HE 染色試劑盒購、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，γ 干擾素誘導蛋白-10（interferon-gamma induced protein 10, IP-10）、高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein 1, HMGB1）酶聯免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購自上海酶聯公司，JAK1、STAT1一抗購自德國CST 公司。正置顯微鏡購自日本Nikon 公司，多功能酶標儀購自美國Bio Tek 公司，電泳儀及凝膠成像儀購自上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組、模型復制及給藥8 只C57BL/6 正常小鼠作為對照組；32只MRL/lpr狼瘡小鼠隨機分為模型組、TPL 組、JAK1 組、TPL+JAK1 組，每組8只。模型組給予生理鹽水灌胃，連續9周；TPL 組給予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，連續9 周；JAK1 組給予JAK1 腺病毒懸液10 μl 單次尾靜脈注射；TPL+JAK1 組給予0.125 mg/（kg·2 d）TPL 灌胃，連續9周，以及JAK1腺病毒懸液10 μl單次尾靜脈注射。

1.3.2 尿蛋白及Scr、BUN 的檢測末次灌胃后開始收集24 h 尿，然后處死小鼠收集血清，檢測24 h尿蛋白及Scr、BUN 水平，按照試劑盒說明書進行操作，配置反應體系后在全自動生化分析儀上檢測相應指標。

1.3.3 腎臟HE染色及免疫熒光染色處死小鼠后解剖雙側腎臟，左側腎臟用4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，制作病理切片后行HE 染色，在顯微鏡下觀察腎臟的病理改變；另取腎臟病理切片行免疫熒光染色，IgG 和C3 一抗的稀釋比例為1∶300，染色后用抗熒光猝滅封片液封片，顯微鏡下觀察并計算免疫熒光強度。以上操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 血清及腎臟中IP-10、HMGB1 質量分數的檢測取血清樣本，采用ELISA 試劑盒檢測IP-10、HMGB1 質量分數。取右側腎臟組織，采用ELISA 試劑盒檢測IP-10、HMGB1 質量分數，計算每毫克腎臟蛋白對應的IP-10、HMGB1 含量。以上操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 腎臟中JAK1、STAT1表達水平的檢測取右側腎臟組織，用RIPA 裂解液提取組織中的蛋白，將30 μg 蛋白樣本加入SDS-PAGE 電泳后濕轉至NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜1 h，用1∶2 000稀釋的JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 一抗4℃孵育過夜；次日，洗膜3 遍后室溫孵育二抗1h，再次洗膜3 遍，采用BCA 試劑盒檢測蛋白。在凝膠成像系統中顯影得到蛋白條帶，用Image J 圖像處理軟件對條帶進行灰度值分析，根據灰度值計算蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平

各組小鼠24 h 尿蛋白及Scr、BUN 比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組較對照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1組較TPL 組高（P<0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠腎臟病理變化

對照組小鼠腎臟大致正常，未出現明顯的病理變化；模型組腎小球毛細血管損傷，炎癥細胞浸潤明顯；TPL 組腎小球毛細血管損傷及炎癥細胞浸潤均較模型組減輕，JAK1 組腎小球毛細血管損傷及炎癥細胞浸潤均較模型組加重；TPL+JAK1 組腎小球毛細血管損傷及炎癥細胞浸潤均較TPL 組減輕。見圖1。

表1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比較 （n=8，±s）

表1 各組小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別24 h尿蛋白/mg Scr/（μmol/L）BUN/（mmol/L）對照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F值P值5.84±0.94 23.32±5.58①10.32±2.52②28.93±6.72②19.29±3.48③37.142 0.000 32.12±6.68 79.49±13.48①45.68±10.23②94.51±14.27②74.51±12.84③37.037 0.000 10.38±2.35 35.75±8.49①17.68±4.51②42.49±9.24②33.24±8.68③27.619 0.000

圖1 各組小鼠腎臟病理變化 （HE染色×200）

2.3 各組小鼠腎臟IgG及C3的免疫熒光強度比較

各組小鼠腎臟IgG 及C3 免疫熒光強度比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組較對照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1組較TPL 組高（P<0.05）。見表2 和圖2、3。

2.4 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1 的質量分數

各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1 的質量分數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組較對照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1 組較TPL 組高（P<0.05）。見表3。

2.5 各組小鼠腎臟中JAK1、STAT1蛋白相對表達量

各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組較對照組高（P<0.05），TPL 組較模型組低（P<0.05），JAK1 組較模型組高（P<0.05），TPL+JAK1 組較TPL 組高（P<0.05）。見表4和圖4。

表2 各組小鼠腎臟IgG和C3的熒光強度比較 （n=8，±s）

表2 各組小鼠腎臟IgG和C3的熒光強度比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別C3 IgG對照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值0.89±0.18 6.29±1.07①1.88±0.35②8.04±1.22②5.77±0.86③105.498 0.000 1.02±0.24 6.68±0.94①2.21±0.45②8.20±1.32②5.96±1.02③95.341 0.000

圖2 各組小鼠腎臟IgG的熒光強度 （免疫熒光染色×400）

圖3 各組小鼠腎臟C3的熒光強度 （免疫熒光染色×400）

表3 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1的質量分數比較 （n=8，pg/mg，±s）

表3 各組小鼠血清及腎臟中IP-10、HMGB1的質量分數比較 （n=8，pg/mg，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

血清腎臟組別對照組HMGB1 2.77±0.52 IP-10 8.39±1.32 HMGB1 20.38±5.58 IP-10 1.84±0.35模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值8.21±1.32①4.02±0.77②11.28±1.94②8.33±1.42③57.591 0.000 26.58±4.52①13.47±2.44②34.28±7.69②24.57±5.56③36.801 0.000 65.85±12.12①31.38±8.38②80.28±15.52②59.49±11.74③39.418 0.000 5.58±0.89①3.02±0.65②7.35±1.24②5.34±0.81③54.325 0.000

表4 各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

表4 各組小鼠腎臟中p-JAK1、p-STAT1蛋白相對表達量比較 （n=8，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與TPL組比較，P<0.05。

組別p-JAK1 p-STAT1對照組模型組TPL組JAK1組TPL+JAK1組F 值P 值0.45±0.08 0.78±0.14①0.54±0.10②1.08±0.16②0.84±0.17③27.766 0.000 0.67±0.11 0.83±0.16①0.54±0.08②1.14±0.22②0.79±0.13③18.366 0.000

圖4 各組小鼠腎臟JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白的表達

3 討論

腎臟是SLE 常見的受累臟器，腎臟局部補體過度激活、炎癥細胞因子異常分泌、免疫復合物沉積是引起腎臟損傷的主要病理因素[8-10]。在臨床實踐中，LN 是造成SLE 預后不良的危險因素，也是終末期腎臟病的常見病因，在SLE 的病情發展變化過程中對腎損傷進行積極防治具有積極的臨床意義[11-13]。

目前，臨床上治療SLE 的主要藥物包括糖皮質激素、羥氯喹、環磷酰胺等，起效迅速但毒副反應相對較多，并且缺乏治療LN 的有效藥物。雷公藤是具有清熱解毒、祛風通絡作用的中藥，TPL是雷公藤中重要的活性成分，已被證實能夠用于SLE、類風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病的治療[14-15]，也有研究報道TPL 在腎小球腎炎治療中的價值[16-17]。近些年，陸續有國內學者報道了TPL 在腎臟疾病治療中的價值，秦登優等[5]和劉玉芳等[6]的研究分別以MRL/lpr 狼瘡小鼠和Pristane 誘導的狼瘡小鼠為研究對象，給予TPL 灌胃后觀察到小鼠的腎損傷明顯改善。本實驗參照秦登優等[5]的研究，使用MRL/lpr 狼瘡小鼠進行研究，并給予TPL 灌胃干預，通過生化指標及腎臟病理改變、免疫熒光染色結果發現24 h 尿蛋白、Scr、BUN 減少，腎臟病理改變減輕，IgG 及C3 的熒光強度減弱，表明TPL 干預使MRL/lpr 狼瘡小鼠的腎損傷減輕，表現為腎功能的改善、局部免疫復合物及補體沉積的減少，這與既往關于TPL 改善狼瘡小鼠腎功能的報道一致[5-6]，提示TPL 可能在LN 防治中具有積極作用。

雖然越來越多的研究證實TPL 在SLE、LN 治療中的價值，但是其分子機制尚不十分清楚。腎小球系膜是LN 病理損傷主要累及的部位，施棟梁等[7]、陳硯凝等[18]及XU 等[19]以腎小球系膜細胞為研究對象進行了細胞實驗，通過IFN-γ刺激的方式模擬SLE發病過程中腎損傷的病理特征，觀察到細胞中JAK1/STAT1 通路過度激活、下游促炎細胞因子IP-10 及HMGB1 的表達增加，IP-10、HMGB1 能夠在局部招募免疫細胞，引起免疫應答紊亂，促進免疫復合物沉積，進而造成腎損害的發生。由此推測，JAK1/STAT1通路激活后IP-10、HMGB1表達增加可能參與SLE發病過程中的腎損害。而在IFN-γ刺激的同時予以TPL 干預后，JAK1/STAT1 通路的激活及下游IP-10、HMGB1 的表達均受到抑制，由此提示TPL 對JAK1/STAT1 通路的激活具有抑制作用，這也可能是TPL發揮治療作用的分子機制。

LN 相關的動物實驗表明，LN 動物腎臟中JAK1/STAT1 通路活化[20-22]，抑制該通路能夠減輕LN 的腎損害[23]。本實驗在闡明TPL對狼瘡小鼠腎功能的改善作用后，進一步分析了JAK1/STAT1 通路在TPL 改善腎功能中的作用。狼瘡小鼠血清、腎臟中IP-10、HMGB1 的質量分數及腎臟中p-JAK1、p-STAT1 的表達水平均明顯升高，表明狼瘡小鼠腎組織JAK1/STAT1通路過度激活，與IFN-γ刺激后腎小球系膜細胞中JAK1/STAT1 通路過度激活的趨勢一致；采用TPL 對狼瘡小鼠進行干預后，血清、腎臟中IP-10、HMGB1 的質量分數及腎臟中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相對表達量均明顯降低，表明TPL 能夠抑制狼瘡小鼠腎臟中JAK1/STAT1 通路的激活，這可能是TPL 減輕腎損傷的分子機制。為了進一步驗證這一機制，本實驗設計了過表達JAK1 的腺病毒，尾靜脈注射腺病毒后進行TPL干預，結果發現TPL減輕腎損傷、減少免疫復合物及補體沉積、降低IP-10 及HMGB1 的作用明顯被削弱，由此證實抑制JAK1/STAT1 通路是TPL 減輕狼瘡小鼠腎損傷的分子機制，TPL 能夠通過抑制JAK1/STAT1減輕狼瘡小鼠腎臟的病理改變。

綜上所述，TPL 減輕MRL/lpr 狼瘡小鼠腎損傷的分子機制可能是抑制JAK1/STAT1 通路介導的炎癥反應，未來TPL 有望成為治療SLE、預防LN 的候選藥物。