大麻素2型受體激動(dòng)劑對膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響*

高翠敏，郭娜，寧海慧，邢博民，馬玉清

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)，甘肅 蘭州730099；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 麻醉科，甘肅 蘭州730099）

膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)所導(dǎo)致的危及生命的多器官功能障礙[1]。急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）是膿毒癥最嚴(yán)重、最常見的并發(fā)癥[2]，其發(fā)生機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、腎近端小管上皮細(xì)胞損傷及腎臟局部微循環(huán)障礙有關(guān)[3-4]。大麻素2 型受體（CB2R）主要存在于免疫細(xì)胞上，參與免疫調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗炎作用[5-6]。膿毒癥時(shí)，CB2R 表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[7]。自噬是一種重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制，通過主動(dòng)消除細(xì)胞內(nèi)微生物，促進(jìn)抗原呈遞，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和去除受損細(xì)胞器（如線粒體）來抵御微生物入侵，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，激活CB2R 可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬作用，促進(jìn)高遷移率族蛋白B1 的降解，減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)[10]。但激活CB2R 對膿毒癥AKI是否有保護(hù)作用，以及其與自噬的關(guān)系，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究采取盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，探討CB2R 激動(dòng)劑JWH133 對膿毒癥大鼠AKI 的影響及與自噬表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康成年SD 雄性大鼠24 只[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2018-0002]，8 周齡，體重（200±20）g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。CB2R激動(dòng)劑JWH133 購自美國APExBIO 公司，血清肌酐（Scr）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，兔抗鼠Beclin-1、兔抗鼠Atg-5 一抗購自美國ABclonal 生物技術(shù)有限公司，羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型復(fù)制

將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham 組）、膿毒癥組（Sep 組）及膿毒癥+CB2R 激動(dòng)劑JWH133 組（Sep+JWH133 組），每組8 只。參照文獻(xiàn)[11]采取盲腸結(jié)扎穿孔法復(fù)制大鼠膿毒癥模型。腹腔注射10%水合氯醛3～4 ml/kg 麻醉，腹部備皮、消毒，沿腹中線打開腹腔，切口約1～2 cm，探查腹腔并找到盲腸。Sham 組僅翻動(dòng)盲腸后關(guān)腹。Sep 組和Sep+JWH133 組分別于盲腸1/2 處用3-0 無菌絲線結(jié)扎，并用18 G 無菌針頭在結(jié)扎段盲腸處來回穿刺2 次，擠出少量腸腔內(nèi)容物，保證穿刺點(diǎn)通暢后，將盲腸回納并逐層關(guān)腹。Sep+JWH133 組于術(shù)后1 h 腹腔注射JWH133 1.5 mg/kg，Sham 組和Sep 組于上述時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。所有動(dòng)物于術(shù)后立即進(jìn)行液體復(fù)蘇。

1.3 標(biāo)本收集及檢測

模型復(fù)制24 h 后心臟取血并對大鼠實(shí)行安樂死，取小腸組織及腎臟組織標(biāo)本待測。

1.3.1 腎功能檢測取血清，按照ELISA 試劑盒說明書，檢測Scr 水平。

1.3.2 小腸組織及腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察分別將小腸組織及腎臟組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。使用等級(jí)量表評估小腸的組織學(xué)損傷程度：0 級(jí)，正常組織學(xué)；1 級(jí)，表面上皮輕微破壞；2 級(jí)，絨毛尖端的上皮細(xì)胞丟失和損傷；3 級(jí)，黏膜血管阻塞、出血和局灶性壞死，絨毛損失少于一半；4 級(jí)，損害擴(kuò)大到絨毛的一半以上[12]。使用Paller 法評估腎小管損傷程度，即200 倍高倍鏡下，每個(gè)視野選取10 個(gè)腎小管進(jìn)行評分，按5 個(gè)視野（50 個(gè)腎小管）計(jì)分，評分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平計(jì)1分；腎小管內(nèi)出現(xiàn)管型計(jì)2分；腎小管管腔內(nèi)有脫落、壞死細(xì)胞，但未成管型或細(xì)胞碎片計(jì)1分；上皮細(xì)胞顆粒變性計(jì)1分；空泡變性計(jì)1分；細(xì)胞核固縮計(jì)1分[13]。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法通過免疫組織化學(xué)法檢測腎小管自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5 的表達(dá)水平。取腎臟組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片。分別加入兔抗鼠Beclin-1 一抗（稀釋度1∶100）、兔抗鼠Atg-5 一抗（稀釋度1∶100），37℃孵育60 min；PBS 洗滌3 次，3 min/次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋度1∶100），室溫孵育30 min；DAB 顯色，過蒸餾水，蘇木精復(fù)染，脫水，樹膠封片，光鏡下觀察腎臟組織并采用Image Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠小腸組織病理改變

Sham 組為正常小腸組織，無血管破壞，無炎癥細(xì)胞浸潤，小腸組織損傷程度為0 級(jí)；Sep 組可見小腸絨毛上皮組織缺失或連續(xù)性中斷，黏膜血管出血，炎癥細(xì)胞大量浸潤，組織損傷程度≥3 級(jí)；Sep+JWH133 組小腸組織病變明顯減輕，絨毛上皮組織較完整，僅有少許血管出血，少量炎癥細(xì)胞浸潤，組織損傷程度≤2 級(jí)。見圖1。

圖1 小腸組織病理切片 （HE染色×200）

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變

Sham 組腎臟組織形態(tài)學(xué)正常，可見正常的腎小管管腔，腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則；Sep 組腎臟正常形態(tài)被破壞，腎近端小管上皮細(xì)胞排列紊亂，腎小球體積明顯增大，系膜細(xì)胞腫脹，間質(zhì)有明顯出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤；Sep+JWH133 組腎臟結(jié)構(gòu)較完整，間質(zhì)僅有少量出血及炎癥細(xì)胞浸潤。見圖2。

2.3 各組大鼠腎功能變化及腎小管損傷程度評分

各組大鼠Scr、腎小管Paller 評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Sep 組和Sep+JWH133 組較Sham 組升高（P<0.05），Sep+JWH133 組較Sep 組降低（P<0.05）。見表1。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理切片 （HE染色×200）

表1 各組大鼠Scr、Paller評分比較 （n=8，±s）

表1 各組大鼠Scr、Paller評分比較 （n=8，±s）

組別Scr/（μmol/L）Paller評分Sham組Sep組Sep+JWH133組F 值P 值87.15±4.86 108.86±8.46 97.67±4.34 24.809 0.000 2.87±0.75 40.38±1.93 28.50±2.12 1004.364 0.000

2.4 各組腎小管自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

各組腎小管自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5 的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Sep組 和Sep+JWH133 組較Sham 組上調(diào)（P<0.05），Sep+JWH133 組較Sep 組上調(diào)（P<0.05）。見表2 和圖3、4。

表2 各組大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5表達(dá)水平比較 （n=8，±s）

表2 各組大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg5表達(dá)水平比較 （n=8，±s）

組別Beclin-1 Atg5 Sham組Sep組Sep+JWH133組F 值P 值9.95±1.59 16.26±1.77 24.97±2.68 106.290 0.000 4.38±0.56 7.59±0.69 12.79±1.14 206.906 0.000

圖3 各組大鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×200）

圖4 各組大鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白Atg5的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×200）

3 討論

本研究顯示Sep 組大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、畏縮、拒食；Scr 明顯升高；光鏡下小腸絨毛上皮組織缺失或連續(xù)性中斷，黏膜血管出血，炎癥細(xì)胞大量浸潤，腎近端小管上皮細(xì)胞排列紊亂，腎小球體積明顯增大，系膜細(xì)胞腫脹，間質(zhì)有明顯出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤，提示膿毒癥大鼠AKI 模型復(fù)制成功。

CB2R 屬于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞及外周免疫細(xì)胞上，是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，通過抑制中性粒細(xì)胞粘附聚集，減輕炎癥反應(yīng)[14]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)機(jī)體發(fā)生組織損傷或者炎癥反應(yīng)時(shí)，CB2R 表達(dá)可增加至基礎(chǔ)水平的100 倍以上[15]。本研究參照文獻(xiàn)[16]選擇CB2R 激動(dòng)劑JWH133 1.5 mg/kg 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與Sep 組相比，Sep+JWH133 組大鼠Scr、腎小管Paller評分降低，腎臟結(jié)構(gòu)較完整，腎臟病理損傷輕微，腎間質(zhì)僅有少量出血及炎癥細(xì)胞浸潤。提示CB2R激動(dòng)劑可以調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)，減輕膿毒癥大鼠AKI。推測其機(jī)制可能與JWH133 激動(dòng)劑上調(diào)CB2R的表達(dá)有關(guān)。作為潛在的抗炎藥物，CB2R 激動(dòng)劑已被證實(shí)在治療眼部炎癥性疾病方面有重要作用[17-18]。但CB2R 激動(dòng)劑是否通過增強(qiáng)自噬的表達(dá)來發(fā)揮對膿毒癥AKI 的保護(hù)作用，目前尚未完全明確。

腎近端小管上皮細(xì)胞損傷是AKI 的主要發(fā)生機(jī)制之一，MEI 等[19]發(fā)現(xiàn)，自噬能夠拮抗細(xì)胞凋亡，對LPS 介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。膿毒癥早期，革蘭陰性菌的脂多糖與Toll 樣受體4 結(jié)合，通過MAPK/p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸激活了自噬，而脂磷壁酸與Toll 樣受體2 的結(jié)合則誘導(dǎo)了自噬，并通過促進(jìn)自噬體的形成使自噬表達(dá)增強(qiáng)[8]。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 參與早期自噬，促進(jìn)自噬小泡的成核和從細(xì)胞溶質(zhì)招募蛋白質(zhì)，是自噬體形成的標(biāo)志[20]。自噬相關(guān)蛋白Atg5 是參與自噬過程的特異性蛋白，同時(shí)也是LC3 脂質(zhì)化必不可少的因子，而LC3 脂質(zhì)化是自噬誘導(dǎo)的標(biāo)志[20]。本研究觀察到，Sep 組大鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 和Atg5的表達(dá)水平有所上調(diào)，表明膿毒癥AKI 時(shí)自噬被誘導(dǎo)，與MEI 等[19]報(bào)道的自噬可能通過拮抗膿毒癥介導(dǎo)的腎近端小管上皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對腎組織的保護(hù)作用結(jié)果一致。使用CB2R 激動(dòng)劑JWH133 后，膿毒癥大鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 和Atg5 的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)，同時(shí)腎臟病理損傷減輕，Scr 及腎小管損傷評分下降，說明CB2R 激動(dòng)劑可能通過增強(qiáng)膿毒癥大鼠腎臟的自噬表達(dá)水平，拮抗腎小管上皮細(xì)胞損傷，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，激活CB2R 能夠減輕膿毒癥大鼠AKI，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)和促進(jìn)膿毒癥大鼠腎近端小管上皮細(xì)胞自噬，減輕炎癥反應(yīng)，拮抗腎近端小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)或?yàn)槟摱景YAKI 的治療提供新的方向。