CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡影響

張 運(yùn) 秋，潘 悅，陶 旭 鋒，肖 桂 山

( 大連理工大學(xué) 化工學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

乳腺癌的發(fā)病率和致死率位居高位，并且發(fā)病率逐年升高，這導(dǎo)致乳腺癌逐漸成為威脅女性健康的首位惡性腫瘤[1-3]．2018年全球乳腺癌占新發(fā)癌癥病例的24.2%，占癌癥死亡病例的15.0%．在全球范圍內(nèi)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率分別在154個(gè)和104個(gè)國家排名第一[4]，每4個(gè)女性癌癥患者中就有1個(gè)是乳腺癌患者[5]．乳腺癌治療主要以外科手術(shù)和化療為主[6-7]．廣大女性乳腺癌患者因手術(shù)治療存在創(chuàng)傷面大、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)而選擇化療[8]，然而大部分的患者經(jīng)過長期化療之后會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[9]．這一現(xiàn)象嚴(yán)重影響了乳腺癌患者的生活質(zhì)量及疾病預(yù)后[10-12]，因此發(fā)現(xiàn)新的抗乳腺癌藥物意義重大．

抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的主要方式有誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞周期、自噬和壞死，而凋亡作為主要的方式之一，發(fā)揮著巨大的作用．細(xì)胞凋亡是細(xì)胞通過遺傳編碼進(jìn)行自殺的過程，并且整個(gè)凋亡過程有著嚴(yán)格的調(diào)節(jié)程序[13-14]．細(xì)胞凋亡與許多基因有關(guān)，其被相關(guān)基因嚴(yán)格把控著．作為一個(gè)與腫瘤增殖和凋亡密切相關(guān)的蛋白，p53的激活可以通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡起到抗腫瘤的作用[15]．誘導(dǎo)線粒體內(nèi)源性凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤活性的主要機(jī)制之一[16-17]，大量文獻(xiàn)表明，p53可以激活Bax，從而打開線粒體通道使細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，進(jìn)而激活下游的Caspase-9以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，從而激活線粒體內(nèi)源性凋亡通路．除此之外，Bad作為Bcl-2家族的促凋亡基因之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，Schimmer等[18]發(fā)現(xiàn)，Bad蛋白可以直接誘導(dǎo)凋亡．Bim是Bcl-2家族的重要凋亡調(diào)節(jié)因子，有研究表明DNA損傷會(huì)影響B(tài)im的表達(dá)從而引起細(xì)胞的凋亡[19]．

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)主要作為納米材料合成過程中的打孔劑[20]，與陰離子和非離子等均具有良好的配位性，這樣的結(jié)構(gòu)特性導(dǎo)致其也是較好的兩性表面活性劑，并且具有良好的乳化、抗靜電、殺菌及生物降解性．近期有研究表明以CTAB為首的一系列具有長碳鏈季銨鹽結(jié)構(gòu)的化合物具有抗腫瘤活性，其對(duì)結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等均具有明顯的治療作用[21-22]，低劑量CTAB能夠增強(qiáng)乳腺癌的藥物敏感性[23]，但是CTAB是否能夠具有抗乳腺癌的作用，還有待探索．因此，本研究擬初步探討CTAB是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231的凋亡有影響，以及其是否影響這兩種細(xì)胞系的內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路．

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞系 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231購自美國ATCC細(xì)胞庫．

1.1.2 主要試劑與儀器 CTAB(H9151-100g，純度≥99%)購自美國Sigma公司，F(xiàn)BS、DMEM高糖培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA胰酶購自美國Gibco公司．青鏈霉素混合液(100×)、MTT(1g)試劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司．AV-PI雙染色凋亡試劑盒購自沈陽萬類生物科技公司．RIPA裂解液、Western Blot顯影液購自北京普利萊公司．DMSO購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)化學(xué)試劑購自天津大茂化學(xué)試劑廠．Tween20購自美國Sigma公司．β-actin、p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bim、Bcl-2、P-bcl-2和Bad一抗均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，二抗羊抗兔和羊抗鼠購自美國Proteintech 公司．其他儀器包括生物安全柜購自美國Thermo公司、酶標(biāo)儀購自美國Bio TeK公司、熒光顯微鏡購自日本奧森巴斯公司、Life Attune 聲波聚焦流式細(xì)胞儀購自美國Thermo Fisher公司、凝膠成像儀購自美國伯樂公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231采用含10%FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．每隔2 d換一次液，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)或用于其他實(shí)驗(yàn)．

1.2.2 細(xì)胞活性MTT檢測 用胰酶適度消化生長狀態(tài)良好的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，然后用FBS終止消化，離心棄去胰酶和FBS的混合液，用PBS沖洗離心后棄上清，用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞按照5 000/孔的密度接種到96孔板中，每孔200 μL培養(yǎng)液．過夜培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，按照設(shè)定的給藥濃度梯度進(jìn)行給藥．設(shè)置每個(gè)濃度梯度6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)鋪兩板，在分別給藥24 h和48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃ 孵箱孵育4 h后，抽出每孔中含有MTT的培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μL DMSO，將96孔板放在搖床上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下每組的吸光值，用GraphPad Prism 5.0計(jì)算不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率以及藥物的IC50值．

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 待MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，取IC50值(相近的濃度值)進(jìn)行給藥，對(duì)照組給同等體積的空白溶劑，給藥24 h后，用PBS輕輕沖洗掉死細(xì)胞，放置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并在光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察拍照．

1.2.4 細(xì)胞凋亡率的檢測 培養(yǎng)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，根據(jù)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的IC50值，設(shè)定MCF-7的給藥濃度為0.75、1.5、3 μg/mL，設(shè)定MDA-MB-231的給藥濃度為0.5、1.0、1.5 μg/mL，給藥24 h后，收集用CTAB處理的細(xì)胞及空白對(duì)照組的細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化時(shí)間不宜過長以避免假陽性，消化適當(dāng)時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，用PBS清洗兩次得到干凈的細(xì)胞，然后根據(jù)說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率．

1.2.5 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用胰酶消化待提取的細(xì)胞，PBS清洗2遍，離心留取細(xì)胞，加入RIPA裂解液和PMSF的混合液(混合比例50∶1)，置于冰上孵育10 min，每隔5 min渦旋振蕩30 s，離心后留取上清液保存于-80 ℃．使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量蛋白濃度，按比例加入5×上樣緩沖液后95 ℃、10 min，保存于-20 ℃冰箱.每條泳道加入30 μg蛋白樣品，設(shè)置恒壓70 V約30 min跑完濃縮膠，然后調(diào)至恒壓140 V跑完分離膠．切取目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移至甲醇活化好的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜恒流300 mA約90 min，牛奶封閉1 h，用TBST清洗膜3次(5 min/次)，加入一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃ 孵育過夜，再用TBST清洗3次(10 min/次)，室溫孵育二抗1 h，TBST清洗3次(10 min/次)，將膜用ECL高敏顯影液避光孵育2 min，然后置于凝膠成像儀中顯影．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用

CTAB化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，本研究選取兩種乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)將6.25 μg/mL設(shè)定為MCF-7細(xì)胞系的最大給藥終濃度，按照2/3梯度稀釋依次設(shè)定濃度梯度(0、0.37、0.55、0.82、1.23、1.85、2.78、4.17、6.25 μg/mL)．同理，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)將1.56 μg/mL設(shè)定為MDA-MB-231細(xì)胞系的最大給藥終濃度，按照4/5梯度稀釋依次設(shè)定濃度梯度(0、0.33、0.41、0.51、0.64、0.80、1.00、1.25、1.56 μg/mL)．用以上設(shè)定濃度分別處理乳腺癌細(xì)胞系24 h和48 h，結(jié)果顯示CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞有明顯的殺傷作用(圖2，P<0.05)，經(jīng)計(jì)算作用24 h，MCF-7的IC50是1.32 μg/mL，MDA-MB-231的IC50是0.82 μg/mL(表1)．因此，CTAB對(duì)于乳腺癌細(xì)胞確實(shí)具有一定的殺傷作用．

圖1 CTAB的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響

為了更直觀地觀察CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，本研究分別選用兩種細(xì)胞系的IC50值(附近濃度值)1.5 μg/mL和1.0 μg/mL處理MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系，24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTAB能夠引起乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的明顯變化，與對(duì)照組相比，給藥后細(xì)胞變細(xì)變長(圖3)，說明給藥后細(xì)胞狀態(tài)不是很好，可能是發(fā)生了早凋現(xiàn)象．由此本研究得出CTAB能夠引起乳腺癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，推測CTAB可能能夠引起乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象．

表1 CTAB在不同時(shí)間下對(duì)乳腺癌細(xì)胞的IC50值

2.3 CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用

為了進(jìn)一步明確CTAB殺傷乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究用AV-PI雙染的方式檢測CTAB對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的作用．根據(jù)MCF-7細(xì)胞給藥24 h的IC50值，設(shè)定給藥濃度為0.75、1.5、3 μg/mL；根據(jù)MDA-MB-231細(xì)胞給藥24 h的IC50值，設(shè)定給藥濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL．結(jié)果表明，CTAB殺傷乳腺癌細(xì)胞可能是通過誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的，隨著CTAB的濃度增加，其凋亡率也明顯增加(圖4、5)．用0.75、1.5、3 μg/mL的CTAB處理MCF-7細(xì)胞24 h后，其凋亡率分別為5.12%、8.68%和22.21%(圖4)；用0.5、1.0、2.0 μg/mL的CTAB處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h 后，其凋亡率分別為8.83%、10.19%和17.75%(圖5)．以上結(jié)果表明，CTAB能夠一定程度上誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231凋亡．

2.4 CTAB誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞線粒體內(nèi)源性凋亡機(jī)制

為了研究CTAB誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究用1.5 μg/mL CTAB處理MCF-7，24 h，檢測細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)量．結(jié)果顯示，經(jīng)CTAB處理的MCF-7細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)量R明顯增加(圖6)，因此本研究認(rèn)為CTAB可能通過激活p53來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡．在化療藥物引起的凋亡里，線粒體內(nèi)源性凋亡一直扮演著非常重要的角色．為了進(jìn)一步研究CTAB誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的方式，本研究檢測了線粒體內(nèi)源性凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2、P-bcl-2、Bax、Bad、Bim、Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3在MCF-7細(xì)胞中給藥前后的表達(dá)量．結(jié)果顯示，CTAB給藥24 h內(nèi)抑制Bcl-2蛋白的磷酸化，并且激活與線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)的促凋亡蛋白Bax、Caspase-9、Cleaved Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bad以及Bim(圖6)．因此本研究提出CTAB可能是通過激活p53誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞線粒體內(nèi)源性凋亡．

3 結(jié)果討論

目前有文獻(xiàn)表明CTAB對(duì)p53野生型結(jié)腸癌具有更好的抗腫瘤活性．因此本研究猜測CTAB的抗腫瘤作用可能與p53相關(guān)[14-15]．本研究采用Western Blot法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTAB處理MCF-7細(xì)胞24 h后p53表達(dá)量明顯增加，證明了CTAB確實(shí)與p53相關(guān)，且CTAB能夠促進(jìn)p53蛋白的表達(dá)，更加直接明了地驗(yàn)證了CTAB能夠激活p53這一關(guān)系．

Bcl-2家族在調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)源性凋亡的通路中發(fā)揮著重要的作用，該家族中和凋亡相關(guān)的成員眾多，其中包括本研究中所探索的Bax等促凋亡蛋白和Bcl-2等抗凋亡蛋白[24]，文獻(xiàn)顯示，Bcl-2/Bax可調(diào)控細(xì)胞凋亡并在乳腺癌治療中發(fā)揮著非常重要的作用[25]．葉惠榮等[26]研究表明，靈菌紅素通過上調(diào)Bim抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡．梁歡等[27]研究顯示維生素D可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡．本研究采用一系列濃度梯度CTAB處理人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞24 h和48 h后，發(fā)現(xiàn)隨著CTAB濃度增加，細(xì)胞增殖明顯被抑制；流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示，MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率隨著CTAB濃度梯度逐漸增加．并且經(jīng)CTAB處理后，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的Bax、Bad、Bim等蛋白表達(dá)量升高，P-bcl-2的表達(dá)量降低．Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Caspase-9及Cleaved Caspase-9在細(xì)胞的再生與凋亡代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用．本研究中，CTAB用于MCF-7細(xì)胞后，Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)均較對(duì)照組增加，提示CTAB通過促進(jìn)線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡．

目前越來越多的納米材料被應(yīng)用于抗腫瘤的治療，近期許多研究表明CTAB在一定的劑量范圍內(nèi)，也可以起到抗腫瘤作用，同時(shí)還具有一定的選擇性殺傷作用，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值[28]，因此本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明CTAB具有良好的抗乳腺癌作用，為其應(yīng)用于未來乳腺癌的治療提供了一定的理論依據(jù)．但是本研究沒有進(jìn)一步具體驗(yàn)證在CTAB促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231凋亡的進(jìn)程中，p53和線粒體內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白的具體作用關(guān)系，有待進(jìn)一步研究．

4 結(jié) 語

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明CTAB是通過激活p53抑制Bcl-2的磷酸化，增加Bax、Bad以及Bim蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而打開線粒體通道激活下游的Caspase-9以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3激活線粒體內(nèi)源性凋亡通路，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡．