陸地棉細胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆與功能分析

張 翼，邵冬南，薛 飛，李虎情，王學峰，李艷軍，張新宇，劉 峰，孫 杰

(石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室, 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】作物矮化不僅能提高抗倒伏能力，也有利于提高栽培密度和增加產量和機械化作業[1]。陸地棉(Gossypiumhirsutum)是錦葵科(Malvaceae)棉屬(Gossypium)雙子葉植物，其頂尖具有無限生長能力。生產上主要采用人工打頂和和施用縮節胺、氟節胺等生長調節劑[2]調控其生長。克隆株高相關基因，研究棉花株高發育分子機制，對培育適應機械化采收棉花品種具有重要意義。【前人研究進展】油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)是一類具有高生理活性的甾體激素，被稱為繼生長素(Auxin，IAA)、細胞分裂素(Cytokinins，CTK)、赤霉素(Gibberellins，GA)、脫落酸(Abscisic Acid，ABA)、乙烯(Ethylene，ET)之后的第6大激素，主要參與植物細胞分裂分化[3]、莖的伸長[4]、根的發育[5]、葉片彎曲[6, 7]、花粉管延伸[8]和種子萌發[6]等生長發育過程。油菜素內酯(brassinolide，BL)作為生物活性最強的一種BRs，在植物生長發育中起著至關重要的作用[9, 10, 11]。細胞色素P450超家族中的CYP85亞家族在BL生物合成起到關鍵的催化作用。研究發現，番茄CYP85A3、擬南芥CYP85A1能將6-脫氧茶甾酮(6-deoxoCS)氧化為茶甾酮(castasterone，CS)，擬南芥CYP85A2進一步將CS轉化BL，這是植物細胞中BL合成的最后一步，也是關鍵的限速步驟[8, 12-14]。植物中CYP85A的突變體大多都表現為植株矮化，如番茄CYP85A1缺陷突變體因缺乏 BL導致植株嚴重的矮化[7, 9]，豌豆BR缺失型突變體表現出株高介于野生型和BR突變體之間的表型[15]，黃瓜CYP85A1基因突變體表現出節間縮短的超緊湊表型[16, 17]，竹子CYP85A1基因也被證實具有促進莖稈及節間伸長的作用[18]。【本研究切入點】擬南芥CYP85A2介導CS向BL的轉化，這是BL生物合成的最后一步，也是重要的限速步驟[14]，但棉花CYP85A基因對棉花株高的影響尚不清楚，研究以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)的氨基酸序列為查詢序列與陸地棉基因組數據進行比對，獲得了該基因在陸地棉的直系同源基因Ghir_A07G008770，命名為GhCYP85A2-1。構建該基因VIGS沉默載體，對棉花幼苗進行侵染，分析其對棉花株高的影響。【擬解決的關鍵問題】研究解析GhCYP85A2-1基因在棉花株高發育中的作用，為棉花矮化分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種新陸早61號由石河子大學農學院棉花遺傳育種課題組提供。新陸早61號棉花種子種植于人工培養箱內，培養條件設置：溫度23℃，相對濕度50%，光周期為14 h光照和10 h黑暗。待子葉完全平展(發芽后10 d左右)，挑選長勢均一的幼苗用于后續VIGS侵染實驗。病毒誘導基因沉默(VIGS)體系構建方法中用到的煙草脆裂病毒pTRV1、pTRV2、pTRV2-GhCHLI重組載體以及根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101 均由實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 陸地棉GhCYP85A2亞家族基因生物信息學

以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)的氨基酸序列為查詢序列，在陸地棉全基因組數據(https://www.cottongen.org/)(Gossypiumhirsutum(AD1) TM-1 Genome HAU v1_a1 / v1.1 a1.1)中進行檢索，獲得其在陸地棉直系同源基因。用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)數據庫鑒定該基因結構域。利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)和softberry(http://www.softberry.com/berry.phtml/)對該基因的蛋白質殘基數(aa)、相對分子質量(kD)、理論等電點(pI)等基本理化性質和亞細胞定位進行預測分析。利用NCBI Conserved Domain Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)工具對氨基酸序列進行保守域分析。以棉花GhCYP85A2-1基因(Ghir_A07G008770)的氨基酸序列作為查詢(Query)序列，在UniProt (https://www. uniprot.org/)數據庫中進行 BlastP 搜索其它物種CYP85A亞家族基因及氨基酸序列。利用 MEGA7.0 軟件中的 ClustalW 程序進行多重序列比對，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining，NJ，BootStrap = 1 000)構建基因家族進化樹。

1.2.2GhCYP85A2-1基因VIGS載體的構建

取棉花幼嫩葉片，用EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取棉花葉片總 RNA。按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(TaKaRa)說明書合成 cDNA 鏈，-80℃保存備用。

以GhCYP85A2-1基因cDNA為模板，用Primer 3(http://primer3plus.com/)在線軟件設計引物，并在上下游引物5’端中分別加入EcoRⅠ(GAATTC)和KpnⅠ(GGTACC)酶切位點。以cDNA為模板PCR擴增目的基因片段(312 bp)，PCR反應體系：cDNA模板1.0 μL、10 × Buffer2.0 μL、dNTPs (2.5 mmol/L)1.6 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL、Ex-TaqDNA 聚合酶(TaKaRa，5 U/μL)0.2 μL、ddH2O補足至20 μL。反應程序為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環，72℃延伸10 min。目的片段利用瓊脂糖膠回收試劑盒(Tiangen)回收純化，具體步驟參見說明書。

將回收的PCR產物連接至pGEM- T?Easy載體(Promega)，轉化到大腸桿菌感受態細胞獲得pGEM-GhCYP85A2-1，質粒進行酶切驗證并送公司測序(北京華大)。用EcoRI和KpnI分別對pTRV2空載體和pGEM-GhCYP85A2-1進行雙酶切，將目標片段與pTRV2載體進行連接，獲得pTRV2-GhCYP85A2-1重組質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞。重組質粒進行雙酶切鑒定并送公司測序，測序結果正確的pTRV2-GhCYP85A2-1重組質粒電擊轉化到根癌農桿菌GV3101中，挑取單克隆進行菌液PCR驗證后-80℃保菌備用。

1.2.3 沉默載體的侵染與轉化

新鮮培養的重組載體pTRV2-GhCHLI(體系對照)、pTRV2-GhCYP85A2-1和pTRV2-00(空白對照)菌液分別與pTRV1按1∶1等體積混勻，離心并收集菌體，以適當體積的重懸液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200 mmol/L 乙酰丁香酮)調節終濃度(OD600約0.8)。重懸后的侵染菌液于室溫放置3～4 h，用無菌注射器將侵染菌液注射到新陸早61號棉花幼苗子葉，未注射的植株為野生型對照(WT)，每個處理15株。WT和接種后植株置于培養箱中，2周后pTRV2-GhCHLI處理組可觀察到真葉被漂白；40 d后觀察并統計pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00(空白對照)和WT表型，分別采集其幼嫩葉片儲存于-80℃備用，重復3次。采用SPSS16.0軟件進行差異顯著性分析，應用最小顯著性差數法(LSD)進行單因素方差分析；Duncan多重比對分析，顯著性水平為P<0.05。

1.2.4GhCYP85A2-1基因沉默效率檢測

分別提取侵染40 d后的pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00(空白對照)和WT幼嫩葉的總RNA，反轉錄合成cDNA。以UBQ7作為內參基因，Primer 3.0 在線軟件設計qRT-PCR特異性引物，qRT-PCR分析相關基因的相對表達量。qRT-PCR反應體系(共10 μL)：cDNA模1 μL、SYBR Green Ⅰ染料(Roche)5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL、ddH2O 3.5 μL。qRT-PCR反應程序為：94℃預變性1 min，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環，72℃延伸1 min，每個實驗樣品設3次重復，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。表1

表1 所用引物Table 1 Primers used in the experiment

2 結果與分析

2.1 陸地棉CYP85A2亞家族基因生物信息學

研究表明，以擬南芥CYP85A2基因(AT3G30180.1)蛋白序列為查詢序列在棉花全基因組數據庫(https://www.cottongen.org/)中進行Blastp比對，共得到6個陸地棉GhCYP85A2基因。棉花CYP85A2亞家族基因全長在1 708～2 408 bp，編碼序列(coding sequence，CDS)長1 116～1 401 bp，編碼371～466個氨基酸，家族成員蛋白質分子量在42.743～53.645 kD，理論等電點(pI)介于8.95～9.31。GhCYP85A2亞家族成員亞細胞定位在內質網(Endoplasmic reticulum)和質膜(Plasma membrane)上。

6個陸地棉基因與擬南芥CYP85A2氨基酸序列相似性在69.57%～54.89%，按相似性高低分別命名為GhCYP85A2-1至GhCYP85A2-6。利用 NCBI Conserved Domain Search 對陸地棉GhCYP85A2氨基酸序列進行保守域分析，6個基因均屬于細胞色素P450超級家族成員，其中GhCYP85A2-1具有典型的油菜素甾體6-氧化酶保守結構域PLN02774，該基因與油菜素內酯合成相關。表2

表2 陸地棉CYP85A亞家族成員序列Table 2 Sequence analysis of CYP85A subfamily members in Gossypium hirsutum L.

2.2 陸地棉與其他物種CYP85A氨基酸序列比對及進化樹

研究表明，利用DNAMAN軟件對擬南芥CYP85A2(AT3G30180.1)、菜豆CYP85A(Q69F95)、番茄CYP85A1(Q43147)、野生大豆CYP85A(A0A0B2P9K9)、煙草CYP85A1(A5X6P9)和6個陸地棉CYP85A2家族基因氨基酸序列進行多重序列比對，發現GhCYP85A2-6氧分子結合區不完整，GhCYP85A2-3和GhCYP85A2-6血紅素結合區缺失，其余基因氨基酸序列均含有完整的CYP85A基因家族高度保守的結構域：C-螺旋、脯氨酸富集區、K-螺旋、Glu-X-X-Arg 結構域、氧分子結合區和血紅素結合區[14]。圖1

研究表明，GhCYP85A2-1、GhCYP85A2-2、GhCYP85A2-5和GhCYP85A2-6基因聚集在一個分支，與核桃和豆科植物親緣關系較近；GhCYP85A2-3和GhCYP85A2-4基因聚集在另一個分支，與向日葵等菊科植物親緣關系較近。6個陸地棉CYP85A蛋白序列中，GhCYP85A2-1與擬南芥CYP85A2(AT3G30180.1)相似性最高，達到69.57%，GhCYP85A2-1基因是CYP85A亞家族成員，GhCYP85A2-1可能具有CYP85A家族成員相似的生物功能，參與陸地棉BL的合成。圖2

2.3 GhCYP85A2-1基因VIGS載體的構建

研究表明，以陸地棉品種新陸早61號GhCYP85A2-1基因CDS序列為模板，設計VIGS沉默片段引物進行PCR擴增(圖3A)，將回收的PCR擴增產物(312 bp)連接到pGEM-T'Easy載體。用EcoRI和KpnI將目的片段進行雙酶切驗證，觀察到與目的條帶相同大小片段(圖3B)。將酶切所得目的片段回收并連接到pTRV2載體，對pTRV2-GhCYP85A2-1質粒進行雙酶切驗證，可觀察到目的條帶及載體條帶(圖3C)。將測序驗證正確的pTRV2-GhCYP85A2-1質粒轉化農桿菌GV3101，并進行菌液PCR驗證，獲得陽性單克隆(圖3D)。圖3

2.4 沉默載體的侵染與轉化

研究表明，pTRV2-GhCHLI、pTRV2-GhCYP85A2-1和pTRV2-00分別與pTRV1菌液等量混合，離心收集菌體，懸浮后侵染新陸早61號棉花幼苗子葉。侵染2周后可觀察到pTRV2-GhCHLI菌液處理的棉花葉片被漂白，試驗材料種植環境適宜，且該VIGS體系適用于試驗中棉花基因功能研究。侵染40 d后分別統計pTRV2-GhCYP85A2-1、pTRV2-00和WT處理組棉花株高。pTRV2-00和WT處理組棉花株高無顯著性差異，而pTRV2-GhCYP85A2-1處理組的棉花株高比pTRV2-00和WT顯著(P<0.05)降低。棉花GhCYP85A2-1基因沉默組與pTRV2-00和WT組相比，平均株高分別降低5.3、5.6 cm。圖4

2.5 GhCYP85A2-1基因沉默效率

研究表明，利用qRT-PCR檢測GhCYP85A2-1基因在棉花侵染植株中的表達量， WT和pTRV2-00侵染組中，GhCYP85A2-1基因表達量無明顯差異，pTRV2-GhCYP85A2-1侵染組中GhCYP85A2-1基因表達量極顯著性(P<0.01)降低，pTRV2-GhCYP85A2-1侵染組中棉花GhCYP85A2-1基因的表達被成功抑制。圖4

3 討 論

油菜素內酯(BRs)是一類對植物莖稈伸長和細胞分裂的高活性物質，能有效調節植株莖稈高度[19, 20]。植物BR缺陷突變體和BR不敏感型突變體普遍矮化，伴有葉柄、下胚軸短等特征[4, 21, 22]。大多數BR缺陷突變體在編碼細胞色素P450(CYP450)的基因活性方面存在缺陷[23]，其中CYP85A亞家族蛋白催化BL生物合成最后的氧化反應，CYP85A亞族基因功能缺失將直接影響植物株高發育。研究表明，CYP85A在竹類植物生長快速階段的基因表達量明顯高于生長緩慢期，對竹類植物莖稈及節間伸長具有重要作用[18]。

已有研究發現，多種植物BR突變體株高出現極端矮化表型[14, 16, 24]。擬南芥CYP85A2敲除突變體表現出與BR缺陷矮化植株相同的表型缺陷，雖然擬南芥CYP85A1活性缺陷的個體沒有任何明顯的表型，但CYP85A1、CYP85A2雙重突變體會加劇CYP85A2突變體的表型，表明CYP85A1和CYP85A2具有重疊的功能[9, 14]。Wang等[16]研究發現黃瓜CsCYP85A1基因突變體植株表現為超緊湊型，節間幾乎沒有伸長，原因可能是黃瓜基因組中雖然有3個CsCYP85A基因，但只有CsCYP85A1基因有活性。

試驗將陸地棉GhCYP85A2-1基因構建VIGS基因沉默載體，并對棉花幼苗進行侵染轉化，發現pTRV2-GhCYP85A2-1處理組與pTRV2-00和WT組相比，GhCYP85A2-1基因沉默后棉花株高顯著性降低(P<0.05)，平均株高分別降低5.3、5.6 cm。株高矮化程度較低原因可能是陸地棉基因組為異源四倍體，陸地棉基因組中有6個GhCYP85A2同源基因，GhCYP85A2亞族基因成員之間可能存在功能冗余。另一方面，試驗通過VIGS技術使陸地棉中GhCYP85A2-1表達量極顯著降低，但植株中該基因并未被完全沉默，可能會影響棉花矮化程度，沒有出現極端矮化表型。已有研究表明，BR與其它激素也存在相互作用，共同調節植物的生長發育。如植物中BR通過誘導GA合成基因D18/GA3ox-2、GA20ox-1、GA20ox-2和GA20ox-5的表達導致植株中活性GA的積累，促進細胞伸長[25, 26]；BR也能通過調節葉片節點生長素信號來促進芽的生長[7]。試驗中GhCYP85A2-1基因被沉默后在降低植株中BR生物合成的同時，可能會進一步影響BR與多種激素間的相互調節作用，最終導致棉花植株矮化。該基因與其他5個GhCYP85A2同源基因在調控棉花株高發育中的分子機制還有待進一步研究。

4 結 論

利用擬南芥CYP85A2基因蛋白序列在陸地棉基因組數據庫中比對，獲得6個陸地棉GhCYP85A2同源基因。陸地棉GhCYP85A2-1基因被沉默后，棉花株高顯著降低，GhCYP85A2-1基因對棉花株高發育有重要調控作用。