基于分光光度法的137份山黧豆種質資源ODAP含量分析

郝曉鵬，王 燕，董 雪，田 翔，趙建棟，暢建武

（山西農業大學農業基因資源研究中心（山西省農業科學院農作物品種資源研究所），農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，中國農業科學院雜糧研究中心（太原），山西太原 030031）

山黧豆（Lathyrus sativus L.）又稱家山黧豆、草香豌豆、牙豆，是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）山黧豆屬（Lathyrus L.）的唯一栽培種，為一種起源于西亞和中東地區的古老作物[1-2]。山黧豆在我國主要種植在甘肅、寧夏、內蒙古、陜西和山西。山黧豆可以食用種子、芽菜，植株可作牧草，因其具有耐旱、耐瘠薄、耐澇、耐鹽堿和抗病蟲的特點，是世界貧窮地區和農業環境惡劣地區的首選作物[3]。盡管山黧豆有上述諸多優點，但由于山黧豆毒素（β-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，β-ODAP）大量存在于其種子、幼苗和植株的根、莖、葉等各組織和各生育期，而長期食用會導致人和牲畜等神經系統的損傷[4]。因此，該毒素是山黧豆農業生產應用的主要限制因素，已成為山黧豆種質資源開發和應用的瓶頸[5-7]。迄今為止，僅鑒定出一些低毒資源[8]，尚未發現山黧豆無毒品種。

山黧豆毒素，即三七素（Dencichine），易溶于水，呈酸性，為一種非蛋白質氨基酸，分子式C5H8N2O5，分子質量176.13 g/mol。目前發現存在于山黧豆（Lathyrus sativus）、豬屎豆（Crotalaria mucronata）、金合歡（Acacia farnesiana）、三七（Panax notoginseng）、人參（Panax ginseng）和蘇鐵（Cycas revoluta）等植物當中，并作為止血、活血藥物的重要功能成分[9]。山黧豆毒素不僅具有藥用功效，而且在植物抗逆性、化感作用、抑制真菌和昆蟲拒食等方面有重要作用[10]。

研究表明，該毒素還存在一個同分異構體（α-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，α-ODAP），毒理學研究得出該異構體沒有神經毒性，而β-ODAP在水溶液、高溫條件或者酸堿性條件下可以向α-ODAP 異構體轉變[11-12]。

本研究采用Emmrich 改進后的Rao 分光光度法[13-14]，對137 份山黧豆種質資源ODAP 含量鑒定，以期篩選出高毒、低毒資源，可為山黧豆無毒、低毒品種篩選和利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 選擇來源于印度、敘利亞、埃塞俄比亞、西班牙、孟加拉國、俄羅斯等國家的137 份山黧豆種質資源，現保存于山西農業大學農業基因資源研究中心種質資源庫。

1.1.2 儀器設備 Synergy H1 全功能微孔板檢測儀（美國BioTek），5804R 高速離心機（德國Eppendorf），HH-600 型水浴鍋（江蘇金分儀器有限責任公司），Dragon lab MX-S 漩渦儀（大龍興創實驗儀器股份公司），Tissue lyser Ⅱ高通量研磨儀（德國QIAGEN），Direct-Q3 超純水儀（美國Millipore）。

1.1.3 試驗試劑 無水乙醇分析純（≥99.7%，天津市開通化學試劑有限公司），KOH 分析純（≥85.0%，天津市恒興化學試劑制造有限公司），鄰苯二甲醛生化試劑（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司），四水合四硼酸鉀生化試劑（≥98.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、β-巰基乙醇生物試劑（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、超純水（自制）、三七素標樣（≥98.0%，上海純優生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 2018 年7 月，將137 份山黧豆種質資源播種于山西省農業科學院大吳創新基地智能溫室中。采用育苗盤進行播種，每穴播種3 粒，每份材料2 個重復。播種后10 d，取葉片放入預先填充變色硅膠的10 mL 離心管當中，4 ℃冰箱中干燥10 d，使葉片完全脫水。分別稱取10 mg 干燥葉片放入含有鋼珠的2 mL 離心管，采用高通量研磨機粉碎成粉末狀。

1.2.2 緩沖液配制（1）稱取鄰苯二甲醛41 mg，溶解于1 mL 乙醇中，加入82 μL β-巰基乙醇，配制成A 液。（2）稱取6.25 g 四水合四硼酸鉀，在60 ℃水浴下溶解并冷卻至室溫，配制成B 液。將A 液與B 液混合，定容于50 mL 容量瓶中，配制成OPA-Tetraborate buffer。

1.2.3 回歸曲線建立方法 稱取0.6 mg 三七素標準樣于2 mL 離心管當中，用1 mL 超純水60 ℃加熱溶解，制備成三七素母液。而后將0.6 mg/mL 母液依次稀釋為0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375 mg/mL 共7 個梯度，每個濃度設置4 個重復。每個樣品檢測4 次，取平均值，并基于不同濃度和吸光度值建立回歸方程。

1.2.4 ODAP 毒素檢測 將10 mg 葉片研磨后的粉末加入1.5 mL 蒸餾水旋渦儀混勻，放入95 ℃水浴鍋當中20 min，提取ODAP 毒素。采用Emmrich 等改進后的Rao 分光光度法，使用BioTek Synergy H1全功能微孔板檢測儀在420 nm 波長進行吸光度（OD）檢測，每個樣品檢測4 次，取平均值。

其中，y 為提取液當中ODAP 濃度（mg/mL），z 為干燥葉片ODAP 百分含量。

2 結果與分析

2.1 回歸方程的建立

由表1 可知，隨著標準樣質量濃度由大到小成比例降低（0.6～0.009 375 mg/mL），各濃度吸光度值呈現成比例的遞減（1.891～0.018）。而變異系數則是由高濃度向低濃度逐漸增大，這是由于隨著質量濃度的降低，儀器本身的系統誤差造成的。

表1 7 個濃度下4 個平行各吸光度值統計

由圖1 可知，采用一元線性回歸模型，最終建立回歸方程y＝0.314 6x＋0.006 7（R2＝0.999 8），其中，x 為水解反應液與對照的吸光度值之差，y 為提取液濃度。

2.2 ODAP 在山黧豆資源中含量分異

在建立回歸方程的基礎上，對137 份山黧豆種質資源苗期10 d 葉片進行取樣。

由圖2 可知，137 份山黧豆葉片當中ODAP 含量平均值為3.552%，最大值為7.307%，最小值為1.065%，標準差為1.115，通過K-S 檢驗，P 值為0.839（P≥0.05），即137 份山黧豆種質資源葉片ODAP 含量符合正態分布。

2.3 山黧豆資源ODAP 含量等級劃分

對137 份山黧豆葉片ODAP 含量進行方差和標準差計算，采用以1δ 為間距（δ 為ODAP 含量標準差，X 為含量平均值），劃分為5 級，其中，1 級＜X-1.5δ，5 級≥X＋1.5δ，每一級相差1δ，ODAP 含量劃分等級如表2 所示。

表2 137 份山黧豆ODAP 含量等級統計

由表2 可知，在137 份山黧豆資源中，ODAP中等級資源有63 份，平均值為3.477%。中低等級和中高等級資源均為29 份，平均值為2.532%和4.566%。低等級和高等級資源均為8 份，平均值分別為1.478%和6.239%。

從變異系數來看，中高等級資源變異系數最低，為0.063，低等級資源變異系數最高，為0.191。

3 結論與討論

有關山黧豆毒素定量檢測方法的研究較多，有Rao 分光光度法[15]、熒光光度法[16]、高效液相色譜法[17-20]、毛細管電泳法[21]和氣相色譜質譜分析法[22]等。分光光度法和熒光光度法檢測準確、操作簡單、快速，但無法區分2 個異構體，高效液相色譜法檢測準確度較高，但操作繁瑣，僅適合少批量精確鑒定，而毛細管電泳法和氣相色譜質譜分析法則應用較少。

分光光度法和高效液相色譜法均是氨基酸及其類似物常用的檢測方法之一[23-24]。其在山黧豆ODAP 檢測中應用較為普遍，其中，分光光度法主要利用ODAP 水解產物α，β-二氨基丙酸（α，β-diaminopropionic acid，DAP）與鄰苯二甲醛（O-phthal aldehyde，OPA）及巰基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-Me）反應形成咪唑-異吲哚的黃色產物，在420 nm條件下有高的吸收峰[9，14，25]。本研究采用Emmrich 改進后的分光光度法較李志孝等[16]熒光光度法和高效液相色譜法[18]減少了樣品前處理繁瑣的技術流程，節省了檢測分析時間，相比較液相色譜方法更加快速、高效。

本研究通過采用Rao 改進后的分光光度法建立了山黧豆ODAP 含量和吸光度的回歸方程，實現了ODAP 含量的快速、準確、高效的檢測。通過頻度分布檢驗，確定毒素含量在137 份山黧豆中呈正態分布，將137 份山黧豆資源ODAP 含量劃分為5 級并篩選到高毒和低毒山黧豆資源各8 份。