萱草屬植物小孢子發育與花蕾長度相關性及花藥培養初探

程宵婧，王榮梅，翟畢嬌，公菲菲，侯非凡，王金耀，武 江，邢國明，亢秀萍，李 森

（1.山西農業大學園藝學院，山西省設施蔬菜提質增效協同創新中心，山西太谷 030801；2.大同黃花產業發展研究院，山西大同 037004）

萱草屬（Hemerocallis）植物是多年生草本植物，多為二倍體材料[1]，該屬植物遺傳周期長達3～4 a，且遺傳背景復雜，雜合度較高，種間和種內生殖隔離嚴重，創制優良種質進程緩慢，開展基因組學研究較為困難。

利用花藥培養單倍體是一種在遺傳改良、簡化遺傳背景上具有極大優越性的育種方式，是一種可在短暫時間內快速獲得由隱性性狀得到充分體現的雙單倍體，縮短了選育時間。此外，利用純合體進行基因選擇的誤選頻率較低，選擇效果較高[2]。世界上第1 株單倍體植株是曼陀羅花藥培育得到的[3]，而后花藥培養被運用到煙草上，并且受到了廣泛的關注。我國于1972 年開始對花藥培養進行研究，目前已經在番石榴、柑橘、小麥等多種植物成功誘導并得到單倍體植株[4-6]，但是萱草屬植物培育單倍體植株未見成功。萱草屬植物花蕾內含有6 個花藥，每個花藥內含有由小孢子發育而來的花粉粒。單倍體培養技術對于創制具有優良性狀的萱草屬植物純合種質、加速萱草屬植物育種進程具有深遠研究意義。

開展小孢子發育過程細胞學觀察是明確花藥培養時期的關鍵前期基礎，是花藥培養獲得單倍體植株的關鍵步驟[7]。植物材料的基因型、培養基蔗糖含量和激素配比是影響花藥培養的重要因素[8]。DIAS[9]對10 個青花菜基因型小孢子進行培養，僅7 個基因型能夠在大量元素較少的培養基中獲得高的胚誘導率。馬菊蘭等[10]對苜蓿的研究表明，2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L 6-BA 和6%～9%蔗糖可以提高花藥愈傷組織的誘導率。

本試驗對山西農業大學萱草屬植物種質資源圃中28 份種質材料進行小孢子發育時期細胞學觀察，并對花蕾大小與小孢子發育時期的關系進行分析，對萱草屬植物花藥離體培養條件進行探索，旨在為下一步研究萱草屬植物單倍體育種技術奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為28 份萱草屬種質材料（表1），取自山西農業大學園藝站萱草屬植物種質資源圃。

表1 供試材料情況

1.2 花粉小孢子細胞學觀察及花蕾長度測量

在各萱草屬種質材料開花前取不同時期的花蕾，用數顯游標卡尺測量花蕾長度，重復6 次。將洗凈后的花蕾固定于卡諾氏固定液中，置于4 ℃冰箱中固定12 h 后，采用95%無水乙醇清洗后置于1 mol/L 鹽酸中60 ℃水浴3 min，再取出花蕾中的花藥使小孢子散出，用卡寶品紅染色后制片，在顯微鏡下觀察不同時期花藥內部小孢子的細胞形態特征并拍照。

1.3 花藥預處理

取28 份萱草屬種質處于單核靠邊期的花蕾，置于4 ℃冰箱低溫預處理24 h 后，流水沖洗5 min放在超凈工作臺上備用，用75%的酒精處理30 s，滅菌雙蒸水清洗1～2 次，用0.1%升汞處理6 min，滅菌雙蒸水清洗2～3 次，將花蕾解離，取出花藥備用。

1.4 花藥離體培養基因型、蔗糖濃度和激素濃度比例的篩選

以MS 培養基為基本培養基，添加4 mg/L 維生素B1促進愈傷組織的生成，花藥離體培養的基因型篩選采用培養基Y1、Y2，蔗糖濃度篩選采用培養基T1～T3，激素濃度篩選采用培養基H1～H28，各培養基配方如表2 所示。每個處理30 瓶，每瓶接種6 個花藥，重復3 次。培養室溫度（25±2）℃、遮光布遮蓋進行暗培養。每天記錄不同處理花藥離體培養效果，45 d 后統計愈傷率。

1.5 數據統計與分析

使用Excel 2019 和SAS 9.2 分別進行試驗數據統計和方差分析。

表2 培養基配方

2 結果與分析

2.1 小孢子發育時期的細胞學觀察

對28 份萱草屬植物連續動態的花藥小孢子發育時期進行細胞學觀察，獲得萱草屬植物小孢子各發育時期的特征，如圖1 所示。通過觀察可將小孢子發育過程分為6 個時期，即小孢子母細胞時期、減數分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期、成熟花粉粒時期。單核靠邊期時細胞體積增大達到正常大小，細胞核變小，液泡將細胞核擠向細胞壁較厚的一側。

2.2 28份萱草屬植物花蕾長度與小孢子發育時期的關系分析

表3 萱草屬植物小孢子各發育時期花蕾長度比較 mm

續表3

不同萱草屬植物小孢子發育時期對應花蕾長度不同。由表3 可知，各萱草屬植物隨著小孢子發育成熟，花蕾長度也隨之增加。小孢子母細胞時期、減數分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期、成熟花粉粒時期的花蕾長度分別為1.87～3.50、3.28～5.66、4.38～7.16、5.82～8.74、6.73～11.52、7.77～12.56 mm。

2.3 萱草屬植物花藥離體培養條件分析

2.3.1 基因型對萱草屬植物花藥離體培養效果的影響

由表4 可知，在28 個萱草屬種質資源中，僅4 個基因型誘導出愈傷組織。H0003 在Y1 培養基中可以誘導出綠色致密愈傷組織，愈傷率最高，可達90%，在Y2 培養基中未誘導出愈傷組織；H0006、H0021均能產生愈傷組織，但顏色稍有差異；H0095 誘導愈傷效果較差，產生黃白色愈傷組織，后期褐化。

2.3.2 蔗糖濃度對萱草屬植物花藥離體培養效果的影響 由表5 可知，在蔗糖質量濃度為30 g/L 時，H0006 和H0095 均在花藥膨大后發生褐化。隨著蔗糖質量濃度升高，花藥培養效果顯著改善，且H0006 愈傷率始終高于H0095。

2.3.3 激素配比對萱草屬植物花藥離體培養效果的影響 28 份萱草屬植物在H1～H10 培養基培養效果較好，在其余培養基培養最終導致花藥褐化失活。由表6 可知，與H1（0 mg/L 2，4-D＋0 mg/L KT）培養基相比，添加不同濃度的2，4-D、KT 的培養基中均能誘導出愈傷組織，但愈傷組織質量存在差異，H0003 于H3 培養基中培養效果較好，產生綠色致密愈傷組織，適于分化培養。H0006 于H3 和H7培養基中培養效果較佳，愈傷率可達90%。

表4 基因型對萱草屬植物花藥離體培養效果的影響

表5 蔗糖濃度對萱草屬植物花藥離體培養的影響

表6 激素濃度配比對花藥離體培養的影響

3 結論與討論

植物雄核的離體培養主要包括小孢子培養和花藥培養，少數植物可以通過離體花蕾培養獲得單倍體[8]。雄核發育的多樣性一般與小孢子發育時期、基因型和培養條件等因素有關[8]。小孢子發育時期是影響花藥培養的關鍵因素，植物花粉小孢子發育是一個動態過程，可分為6 個時期：小孢子母細胞時期、減數分裂期、單核前期、單核靠邊期、二核三核期以及成熟花粉粒時期。花藥在不同發育階段誘導愈傷組織的能力明顯不同。成熟花藥不能誘導產生胚狀體，通常處于單核前期，單核靠邊期的花藥誘導效果最好[11]。本研究中使用了單核靠邊期的花藥進行組織培養，這與丹參[12]、番茄[13]進行花藥培養所選外植體時期一致。

基因型在植物花藥離體培養過程中影響效果顯著。甘泉等[14]通過對16 個不同基因型的粳稻進行花藥離體培養，結果表明，不同基因型粳稻的愈傷誘導能力不同且分化效果差異顯著。本試驗中28 種不同基因型材料花藥離體培養效果差異顯著，僅4 個基因型能誘導出愈傷組織，在相同培養條件下H0003 生長狀態最好，H0006、H0021 次之，H0095 培育效果較差，這與前人研究結果一致。

在植物花藥離體培養中，培養條件對花藥培養效果也具有一定影響。不同蔗糖濃度條件下，離體雄核誘導發育效果不同。李冰冰[15]在培養基中添加20 g/L 蔗糖培養韭菜花藥，成功誘導出組培苗。在本試驗中，H0006 的花藥接種于含有30 g/L 蔗糖的培養基中外植體先膨大后逐漸褐化，生長狀況差，隨著蔗糖濃度的升高，褐化現象減弱，愈傷組織顏色由黃綠色到綠色，花藥培養效果顯著提高；H0095在90 g/L 蔗糖的培養基中才能誘導出黃綠色愈傷組織，在蔗糖濃度低的情況下，花藥均褐化，說明H0095 適合在蔗糖濃度高的培養基中產生愈傷。

2，4-D、BA、KT、ZT 等激素對花藥離體培養效果影響顯著。甜菊花藥在1.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA 的培養基中極易誘導愈傷；草莓花藥在1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2，4-D 的培養基上最易誘導且促進花藥愈傷組織形成；仙客來花藥在0.1 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA 的培養基中誘導愈傷[16-18]。在本試驗中，設置2，4-D 和KT、6-BA 的不同濃度梯度組合，2，4-D 和KT 較適合于萱草屬植物花藥離體培養，不同基因型材料之間培養效果差異顯著。

本試驗對萱草屬植物花藥進行離體培養研究獲得了階段性研究成果，為選擇小孢子的適宜選材時期和最佳培養基提供了直接證據，為小孢子培養單倍體植株奠定了前期基礎。