褪黑素對大鼠擠壓綜合征模型骨骼肌缺血再灌注損傷的影響

胡敏，於四軍

(1.深圳市羅湖區人民醫院 心內科，廣東 深圳 518000；2.中國人民解放軍總醫院第三醫學中心 心內科，北京 100039)

擠壓綜合征是由于軀干或四肢等肌肉及血供豐富部位，經過外界持續性擠壓損傷后出現與缺血再灌注損傷相關的一系列病理生理改變，以橫紋肌溶解、循環衰竭及急性腎損傷為特點的臨床危重癥疾病，多發生在戰爭災害、恐怖襲擊、地震、山體滑坡等事件中[1]。目前擠壓綜合征以大量補液及腎臟替代療法為主要治療手段[2]。由于災害現場環境及醫療條件的限制，很多患者并不能在早期接受腎臟替代治療，因此，急性腎損傷的發生率并沒有得到有效的降低[3]。而擠壓綜合征最主要的特征是在缺血再灌注組織產生大量的氧自由基，氧自由基引起缺血再灌注過程中氧化損傷、橫紋肌溶解。氧自由基是擠壓綜合征的主要病因[4]。因此，自由基清除劑的應用為擠壓綜合征的藥物治療提供了新的思路。有研究表明，褪黑素在大鼠的心肌、肝臟等器官缺血再灌注中發揮清除自由基及抗氧化作用，對靶器官具有保護作用[5-6]。因此，本實驗通過建立擠壓綜合征動物模型來觀察褪黑素對大鼠酸堿平衡紊亂、氧化應激損傷、橫紋肌溶解及存活率等方面的影響，為擠壓綜合征的早期治療、減少擠壓綜合征并發癥的發生以及提高其生存率提供依據。

1 材料與方法

1.1 造模與分組

SPF 級健康雄性wistar 大鼠，體重300 ～350 g，由軍事科學院動物中心供應，實驗動物許可證號編號為：SCXK-( 軍)2012-0004。

實驗大鼠在SPF 級條件下飼養，自由采食與飲水，實驗室室溫控制在23℃左右，室內濕度在(55±15)%，日光燈明暗12 h 交替照射。將Isamu Murata 等擠壓綜合征造模方法加以利用改進[7]，利用5% 戊巴比妥鈉溶液以50 mg/kg 劑量腹腔麻醉大鼠，利用卡式止血帶擠壓大鼠后肢根部，止血帶拉力等同于3 kg 重物的壓力，5 h后撤除止血夾恢復擠壓肢體血流灌注，其間大鼠能自由獲取食物與水。

觀察大鼠生存率的試驗中，保證各組大鼠存活10 只的前提下，取大鼠分為Sham 組(n=10)、CS 組(n=30)、NS 組(n=25)、MEL 組(n=16)，觀察再灌注48 h 各組大鼠死亡的時間點進行生存曲線分析。另取大鼠隨機分為四組：空白組(Sham 組，n=10，除麻醉5 h 外無任何處理)、對照組(CS 組，n=10，擠壓造模后無處理，再灌注6 h)、氯化鈉組(NS 組，n=10，解壓前給予10 mL/kg 氯化鈉擴容，再灌注6 h) 及褪黑素組(MEL組，n=10，解壓前給予10 mL/kg 褪黑素溶液，再灌注6 h)。所有給藥均在解除壓迫前即刻通過鼠尾靜脈5 min內推注。

1.2 試劑和儀器

褪黑素(Sigma 公司，美國)；戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)；血氣生化測試卡片G3+( 雅培公司，美國)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 和丙二醛(MDA) 測定試劑盒( 南京建成生物工程研究所)。

儀器：倒置顯微鏡(Olympus，日本)；雅培i-STAT300血氣分析儀( 雅培公司，美國)；RM6240 多道生理信號采集系統(成都儀器廠)；酶標儀(Beckman 公司，美國)；日立7600 全自動生化分析儀(日立高新技術有限公司)。

此外，4% 多聚甲醛、乙醇、二甲苯、固體石蠟、HE 染色等均由北京雪邦病理實驗室提供。

1.3 標本留取方法

再灌注6 h 時，利用5%戊巴比妥鈉溶液以50 mg/kg劑量腹腔麻醉大鼠，開腹，游離降主動脈及髂動脈；在左右髂動脈分叉處穿刺進針，可穿刺取血，但穿刺前利用肝素鹽水濕潤注射器以防止血液凝固，通過腹主動脈穿刺取血約5 mL，滴取動脈血數滴于血氣生化測試卡片G3+ 采血孔內，通過手持式i-STAT300 血氣分析儀測量動脈血氣，并記錄數據；剩余血液以2 500 r/min，離心20 min，取上清液，測量各組血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性以及MDA 的含量，并利用全自動生化分析儀測量各待測血清鉀離子、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH) 的含量。同時，解剖大鼠雙下肢腓腸肌，用冰生理鹽水沖洗干凈，置于4% 多聚甲醛固定24 h，用于制作石蠟切片。

1.4 主要指標測定方法

依據試劑盒說明書檢測GSH-Px、SOD、CAT 及MDA。利用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清鉀離子、CK 及LDH 含量。

1.5 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件分析數據。計量資料以±s表示。首先驗證四組數據是否服從正態分布及方差齊性；正態分布、方差齊的數據多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett's 法；不服從正態分布資料的數據采用非參數秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 褪黑素提高擠壓綜合征大鼠生存率

CS 組大鼠的生存率為20%，NS 組大鼠的生存率29.2%，MEL 組大鼠的生存率為56.3%，MEL 組大鼠生存率明顯高于CS 組與NS 組，log-rank 檢 驗χ2為23.07，P＜0.01，差異有統計學意義。各組生存曲線見圖1。

圖1 各組大鼠生存曲線

2.2 褪黑素改善酸堿平衡紊亂

與Sham 組比較，CS 組血液中pH 值、HCO3-和剩余堿含量顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05)；與CS 組比較，NS 組血液中pH 值、HCO3-和剩余含量無統計學差異；與CS 組比較，MEL 組血液中pH 值、HCO3-和剩余含量顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠動脈血氣比較(± s)

表1 各組大鼠動脈血氣比較(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

組別 n pH HCO3-/(mmol·L-1) BE/(mmol·L-1)Sham 組 10 7.44±0.01 29.5±0.8 3.4±0.8 CS 組 30 7.30±0.02① 18.2±0.9① -8.5±1.0①NS 組 25 7.32±0.02 21.0±1.2 -6.8±0.9 MEL 組 16 7.41±0.03② 26.8±1.1② 1.5±1.1②

2.3 褪黑素減輕橫紋肌溶解

CS 組血清中鉀、CK、LDH 含量明顯高于Sham組(P＜0.05)；與CS 組相比，MEL 組血清中鉀、CK、LDH 顯著降低(P＜0.05)；而NS 組與CS 組比較，血清中鉀、CK、LDH 含量無統計學差異。見表2。

表2 各組大鼠血清橫紋肌溶解標志物含量比較(± s)

表2 各組大鼠血清橫紋肌溶解標志物含量比較(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

組別 n 鉀/(mmol·L-1) CK/(U·L-1) LDH/(U·L-1)Sham 組 10 4.11±0.36 353±58 150±39 CS 組 30 7.59±0.48① 27 336±685 1① 2 780±360①NS 組 25 7.30±0.48 25 021±524 2 2 622±249 MEL 組 16 6.01±0.45② 13 270±362 4② 1 488±312②

2.4 褪黑素緩解氧化應激

CS 組血清中GSH-Px、SOD、CAT的活性低于Sham 組，MDA 的含量高于Sham 組，差異有統計學意義(P＜0.05)；MEL 組血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性高于Sham 組，MDA 的含量低于Sham 組，差異有統計學意義(P＜0.05)，而NS 組中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平與CS 組比較，差異無統計學意義，見表3。

表3 各組大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比較(± s)

表3 各組大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比較(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

SH-Px/(U·mL-1) SOD/(U·mL-1) CAT/(U·mL-1) 77.6±7.23 319.90±25.20 42.1±1.78 組別 n GMDA/(μmol·L-1)Sham 組 10 2.65±0.39 CS 組 30 48.8±5.31① 179.20±18.42① 25.1±2.65① 6.89±0.39①NS 組 25 52.7±3.48 183.64±15.49 25.7±3.77 6.56±0.84 MEL 組 16 64.7±4.32② 255.86±26.00② 32.3±2.82② 4.54±0.61②

2.5 腓腸肌光鏡下HE 染色結果

Sham 組腓腸肌纖維間未見水腫及炎癥細胞浸潤，肌肉纖維正常分布；CS 組、NS 組腓腸肌纖維間質水腫明顯，肌纖維結構嚴重破壞，骨骼肌橫紋紊亂；MEL 組肌肉纖維間可見輕度水腫，纖維組織稍紊亂，其形態結構明顯好于CS 組與NS 組。見圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌光鏡下HE 染色表現(×200)

3 討 論

擠壓綜合征是由于四肢或軀干等肌肉豐富部位遭受長時間擠壓，在解除壓迫后出現的缺血再灌注損傷，多發生在戰爭災害、恐怖襲擊、地震、山體滑坡等災害性事件中，主要表現出肢體腫脹、橫紋肌溶解、酸中毒、高鉀血癥、急性腎損傷等主要臨床特征。Isamu Murata等[7]通過止血帶擠壓大鼠雙下肢的方法建立了擠壓綜合征動物模型，評估造模大鼠的的臨床特征，證實該模型具有較好的穩定性。近些年來，褪黑素在缺血再灌注損傷實驗中應用廣泛，特別是在腎臟、肝臟及心肌等組織缺血再灌注損傷過程中具有顯著療效[8-10]。本實驗研究中CS 組與MEL 組實驗結果表明，褪黑素能顯著改善減輕下肢缺血再灌注損傷，主要表現在缺血再灌注損傷過程中酸堿平衡紊亂、橫紋肌溶解及氧化損傷程度得到顯著改善，外源性褪黑素干預也同時提高了造模大鼠48 h生存率。

缺血再灌注損傷與自由基的形成密切相關，自由基主要由再灌注過程中大量產生的活性氧(ROS) 轉化而來。ROS 主要在線粒體中產生[11]，線粒體電子傳遞鏈復合物的氧化還原狀態快速變化，造成再灌注時大量的電子加速傳遞給氧，線粒體中ROS 形成大大提高。ROS 誘導胞漿中酶發生變性，通過脂質過氧化過程使細胞膜完整性遭到破壞。ROS 介導的漿網功能障礙也導致大量細胞內鈣超載，導致線粒體通透性轉換孔開放，從而導致細胞壞死。褪黑素為非極性結構，可以穿透細胞膜，在線粒體中濃度最高[12]。有研究表明，褪黑素能抑制線粒體通透性轉換孔開放，減輕缺血再灌注損傷[13]。本研究檢測血清中橫紋肌溶解標志物—血清鉀、CK 及LDH 的釋放并觀察腓腸肌病理改變來反映缺血再灌注損傷后橫紋肌溶解程度，結果表明褪黑素對擠壓綜合癥模型受傷的肌肉細胞具有保護作用。

機體氧化與抗氧化過程處于相互協調及的動態平衡狀態。這種動態平衡一旦被打破，主要表現為缺血再灌注損傷，大量氧自由基形成、中粒細胞激活、線粒體膜電位改變、細胞膜穩定性改變、細胞內皮功能失調等一系列病理生理變化[14]。褪黑素一直以來被認為是一種有效的自由基清除劑[12,15]，同時褪黑激素能促進抗氧化酶如GSH-Px、SOD 和CAT 的活性，從而使其間接發揮抗氧化劑的功能[16-17]。褪黑素的這些特征有效地減輕了氧自由基引起的組織損傷[18]。本實驗結果表明，MEL 組中GSH-Px、SOD、CAT 的抗氧化活性顯著高于CS 組，證實了褪黑素通過直接清除氧自由基、增加內源性抗氧化酶系統的活力而增加對擠壓綜合征大鼠缺血再灌注損傷的保護作用。

擠壓綜合征缺血再灌注損傷引起脂質過氧化反應[19]。脂質膜上不飽和脂肪酸引起級聯反應，從而使細胞膜的流動性和通透性發生改變，最終導致細胞結構和功能的改變，生成有毒性代謝終產物MDA，其含量能有效地反映脂質膜的脂質過氧化反應程度[20]。

褪黑素由人體松果體分泌，正常人體內含有少量的褪黑素，人體內含有一定濃度的褪黑素能起到抗氧化作用。其具有較小的毒副作用，目前，沒有相關資料顯示使用褪黑素會出現嚴重的毒副作用。一項關于40 名[21]晚期腫瘤患者使用大劑量褪黑素(700 mg/d) 的研究發現，6 位患者惡性腫塊出現短暫的減小。De La Lastra等[22]利用褪黑素治療動物胃部缺血在灌注損傷發現，20 mg/kg 的褪黑素劑量能起到最有效的抗氧化作用。此外，我們需要進一步思考的是褪黑素能否應用于災害現場擠壓綜合征的治療？因此需進一步研究褪黑素的藥效動力學及藥物的毒副作用，來指導給藥劑量及給藥方式。本研究證實，褪黑素對擠壓綜合征骨骼肌缺血再灌注損傷具有保護作用，能提高擠壓綜合征模型大鼠的生存率，但褪黑素溶液最佳給藥劑量及給藥途徑仍需我們進一步探究。