偽狂犬病病毒FJSW 的分離鑒定及gG 基因序列分析

傅星源 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起多種家畜和野生動物以發熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。該病毒屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科，又稱豬皰疹病毒Ⅰ型，對豬的危害最為嚴重[1]。 該病易與其他疫病混合感染，曾經在世界上廣泛分布，給養豬業造成的損失僅次于豬瘟和口蹄疫[2-3]。1990 年之后，由于偽狂犬病病毒基因缺失疫苗的使用，該病得到了控制，發病率大大降低，某些地區偽狂犬病病毒凈化取得一定成效[4-6]。 但自2011 年以來，豬偽狂犬病又有反彈趨勢，我國多個省、市、地區的豬場均發生了該病， 造成了一定經濟損失[6-7]。 研究表明，2012 年后流行的偽狂犬病毒株gB、gC、gD、gE 等重要糖蛋白的氨基酸序列發生了突變[8-10]。本試驗通過對福建某豬場疑似偽狂犬病死豬采集組織病料，進行偽狂犬病病毒分離鑒定， 成功分離出偽狂犬病病毒并進行測序。 與Genbank 中的參考毒株進行比較， 對福建地區偽狂犬病病毒株的分子流行病學及毒株溯源進行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 病料樣品及主要試驗材料 病料樣品采集自福建邵武某豬場臨床癥狀疑似偽狂犬病發病仔豬；2×GC Buffer、Taq DNA 聚 合 酶 為TAKARA 公 司產品；dNTP 為上海生工產品； 瓊脂糖為Sigma 公司產品。

1.2 引物設計與合成 檢測引物參照文獻[11]的引物序列進行合成，預期擴增片段長度為347 bp；參照Genbank 中登錄的偽狂犬病病毒基因組序列 （登錄號NC006151）設計一對特異性引物，用于gG 基因擴增，預期擴增片段長度為1 501 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA 提取及PCR 擴增 基因組DNA 提取按照金瑞鴻捷公司taco DNA/RNA 共同提取試劑盒說明書進 行。 PCR 反 應 體 系 為20 uL：2×GC Buffer 10 uL，dNTP (10 mmol/uL) 3 uL，ddH2O 3.8 uL，LA Taq DNA 聚合酶 （5 mmol/uL）0.2 uL， 上下游引物（100 uM）各0.5 uL，DNA 模板2 uL。反應循環參數：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，59 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35 個循環；72 ℃、10 min。 PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 并將陽性產物送至鉑尚生物福州測序部測序。

1.4 病毒分離鑒定 將PCR 鑒定為陽性的腦組織勻漿液-20 ℃反復凍融3 次，12 000 r/min 離心10 min， 吸取上清通過0.22 um 濾器過濾除菌，取1 mL 接種單層Vero 細胞，37 ℃吸附1 h 后棄去接種液， 加入含有2%胎牛血清的DMEM 維持液，37 ℃繼續培養，并設正常對照組。 定時觀察細胞病變，病變達到80%時收獲病毒液，連續傳代3 次后經PCR 進一步鑒定。

1.5 gG 基因PCR 擴增、 序列分析 利用gG 基因特異性引物PCR 擴增得到目的基因片段，并送至鉑尚生物福州測序部測序。 利用生物學分析軟件DNAStar7 將分離株與GenBank 中登錄的參考毒株gG 基因的序列進行比對及同源性分析，分析分離株的序列特征。

表1 序列分析用參考毒株

Bratha、Becker 和Kaplan 為歐美代表病毒株；Ea和LA 為國內以往分離株；其余為國內2012 年后分離株。

2 結果與分析

2.1 病料樣品檢測 將疑似偽狂犬病患豬的腦組織勻漿，提取總DNA 作為模板，利用檢測引物進行PCR 檢測。結果表明，3 頭患豬的腦組織樣品有特異性條帶產生，大小與陽性對照條帶相同，與預期結果相符，表明送檢樣品為偽狂犬病病毒陽性（見圖1）。

2.2 病毒分離培養 陽性腦組織液經勻漿、過濾除菌后接種Vero 細胞，18 h 后即可觀察到細胞圓縮、聚集，24 h 后可以觀察到網狀CPE，48 h 后細胞出現脫落、空斑（見圖2）。 利用檢測引物對培養物進行PCR 鑒定，能夠擴增到特異性目的片段，而利用豬瘟病毒、豬圓環病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等特異性引物進行PCR 擴增均為陰性反應。表明從患豬腦組織中分離出的是偽狂犬病野毒株。

圖1 患豬腦組織樣品PCR 鑒定

圖2 分離株在Vero 細胞上的病變

2.3 核苷酸序列同源性比較分析 對病變的Vero細胞營養液提取DNA， 用偽狂犬病病毒gG 基因特異性引物進行PCR 擴增，獲得與預期大小一致的約1 500 bp 片段，并對其進行測序。結果表明，FJSW 株的gG 基因測序片段長度為1 501 bp。選擇GenBank上參考毒株的gG 基因序列進行同源性對比，FJSW毒株與參考毒株核苷酸同源性為98.9%～100%。 其中與國內2012 年后分離毒株的同源性較高，為99.7%～100%，其中與JS-2012 株的同源性為100%；與歐美分離株的同源性最低，為98.9%～99.1%，其中與Kaplan 株的同源性為98.9%；與國內以往分離株的同源性居中，其中與LA 株的同源性為99.7%，與Ea 株同源性為99.9%。 與各毒株核苷酸的同源性比較見表2。

表2 核苷酸序列同源性比較分析

2.4 基因進化樹分析 基于gG 基因核苷酸序列的遺傳進化分析顯示，FJSW 株與JS-2012 株處于獨立的小分支上， 形成單獨的1 個小亞群， 親緣關系最近，該結果與同源性分析結果相符；與國內2012 年后 分 離 株HeN1、BJ/YT、TJ、XiangA 處 于 同 一 分 支中，表明FJSW 株屬于偽狂犬病病毒變異毒株；而國內2012 年后分離株又與國內以往分離株LA、Ea 處于同一大分支上，形成了一個中國毒株進化群。歐洲分離株Kaplan、Bartha 與美洲分離株Becker 處于另一大分支上。

圖3 基于gG 基因核苷酸序列的遺傳進化分析

3 討 論

自2012 年以來， 我國多地相繼暴發豬偽狂犬病，造成了重大的經濟損失[6-7]。 研究表明，偽狂犬病病毒變異毒株某些重要的糖蛋白在多個方面發生變異，存在毒力增強的情況[8-10]。 gG 糖蛋白位于PRV基因組US 區域，全長1 494 bp，可編碼498 個氨基酸序列，為非結構蛋白，當病毒在細胞內合成該蛋白后被宿主細胞分泌到細胞外。 尚未明確gG 糖蛋白的毒力影響， 但gG 糖蛋白影響偽狂犬病病毒的吸附、擴散、穿透作用，在病毒與宿主細胞之間的擴散具有連接作用，可以抑制細胞遷移，對宿主細胞的凋亡有一定影響，在免疫逃避中扮演重要角色[12]。

為探明FJSW 株與參考株之間的親緣關系，本試驗對FJSW 株的gG 基因進行PCR 擴增、測序，與Genbank 上已發布的參考毒株進行同源性比對和多序列比對分析，并繪制遺傳進化樹。同源性比對結果表明，FJSW 株與2012 年后分離毒株在核苷酸水平上同源性較高，與國外經典毒株同源性較低。遺傳進化樹分析表明， 國內毒株均同屬于同一個分支，且2012 年后分離毒株的遺傳關系更近，FJSW 株與2012 年后分離毒株位于同一分支，與JS-2012 親緣關系最接近； 國內毒株與歐美分離株的遺傳關系較遠。

綜上所述，FJSW 株與2012 年后分離的變異株親緣關系較近，屬于PRV 新流行毒株。在gG 基因上2012 年后分離株與之前的國內外分離毒株存在不同程度的差異，但這些核苷酸水平上的差異對PRV變異株毒力以及免疫原性的影響有待進一步研究。