牛蜱龍巖分離株的分子鑒定

楊 飛 黃翠琴

(1.龍巖學院生命科學學院/福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室 福建龍巖 364012；2.西藏農牧學院動物科學學院 西藏林芝 860000)

蜱系統分類學上屬于節肢動物門（Arthropda）、蛛形綱（Arachnida）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea）。 依據蜱蟲有無殼質化盾板(Seutum)，蜱總科又分為硬蜱科（Ixodidae）、軟蜱科（Argasidae）和納蜱科（Nuttalliellidae）3 個科，共包括13 個屬、867種蜱蟲[1]。 硬蜱具有一個起始于身體前部的堅硬盾板，雌蜱的盾板覆蓋到背部中間部位，而雄蜱的盾板覆蓋其整個背部。硬蜱的口器在背面可見，而軟蜱的口器僅從腹面可見。 蜱體長為3～12 mm，飽血的雌蜱更大。所有蜱蟲都需經歷卵、幼蜱和若蜱階段才能發育為成蜱， 在發育過程中蜱蟲需要一個或多個宿主。 蜱在外界產卵，幼蜱孵出后可在外界感染宿主。硬蜱的幼蜱階段經歷第一次蛻皮成為若蜱， 若蜱階段經歷第二次蛻皮成為成蜱。 在兩次蛻皮期間一直寄生在宿主身上稱為一宿主蜱； 停留在宿主身上蛻化成若蜱， 飽血后脫離宿主， 在外界完成第二次蛻皮， 然后再寄生到新的宿主稱為二宿主蜱。 三宿主蜱的發育過程中，幼蜱、若蜱飽血后便會離開宿主蛻皮，然后再寄生到新的宿主上。所有的蜱蟲都需要附著宿主并經歷幾天的吸血后才能進行蛻皮。 一些蜱蟲在不同發育過程中傾向于寄生相同的宿主種類，另有一些蜱蟲在不同發育過程中則選擇多種宿主種類。 很多軟蜱只有在吸血時才會寄生于宿主身上。

蜱是一類常見于家畜體表的外寄生蟲， 硬蜱具有重要的獸醫學意義， 硬蜱叮咬宿主的部位多數是難以被梳理的部位， 例如宿主的頭部、 耳部以及尾部。 硬蜱可以攜帶細菌、動物原蟲、病毒以及人類的病原體。 通過叮咬吸食宿主血液， 傳播埃立克體病（Ehrlichiosis）、 無形體病 （Anaplasmosis）、 萊姆?。↙yme disease）等人畜共患病[2-4]。 此外，硬蜱還會導致蜱癱和蜱中毒。 因此，應該使用鑷子去除蜱蟲，以防感染蜱內可能含有的病原體。 即使幼蜱體長僅幾毫米，但所有發育階段的蜱均大到肉眼可見。目前發現的蜱種類繁多，由蜱造成的臨床癥狀和病變相似，臨床上很難區分。在獸醫實踐中，形態學鑒定是寄生蟲學研究中傳統的分類鑒定方法， 但是形態學對于不同發育階段的寄生蟲和相似蟲種的鑒別存在著局限性。

福建地區畜牧養殖業較發達， 同時該地區蜱類極為豐富。本研究采集龍巖地區牛體表寄生蜱樣本，并采用基于核糖體DNA （rDNA） 的ITS 序列進行PCR 檢測，通過同源性比較，對龍巖地區牛體表分離的蜱類進行分子鑒定。 ITS 序列具有種間特異性和種內保守性，可以將蜱種類鑒定到種、亞種。

1 材 料

1.1 樣品采集與保存 采集福建龍巖地區某牛場牛蜱數只，分別置于一次性離心管中，標明牛蜱的性別、宿主編號、采集地點以及采集時間。 將蟲體樣品用70%乙醇溶液固定，存放于4 ℃冰箱，用于分子鑒定。

1.2 主要試劑 基因組E.Z.N.A.TM DNA 提取試劑盒購自OMEGA 公司；6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix(100～10 000 bp)購自福州晶泰生物技術有限公司；70%乙醇溶液、DEPC 處理過的水（DEPCtreated water）、2-巰基乙醇 （2-mercaptoethanol）、滅菌去離子水、Taq Plus DNA 聚合酶、10× PCR Buffer（含Mg2+）、dNTP（10 mM）、凝膠回收試劑盒購自北京擎科新業生物有限公司；克隆連接試劑盒購自ThermoFisher 公司。

2 方 法

2.1 引物設計 引物序列由廣東省農業科學院提供，由北京擎科新業生物有限公司合成，引物信息見表1。

表1 ITS 基因引物序列信息

2.2 組織樣品基因組DNA 提取 選取形態完整的蟲體進行稱量，用雙蒸水對蟲體進行沖洗，使用研缽和杵研用約10 mL 液氮下研磨蟲體組織，盡量破碎和均勻化（Homogenization）組織樣品，然后將懸浮液倒入預冷的15 mL 聚丙烯管中。 使用前需將聚丙烯管預先在液氮中冷卻，否則會造成懸浮液劇烈沸騰，造成蟲體組織的損失。 液氮完全蒸發后， 添加Buffer GTC 試劑， 按照基因組E.Z.N.A.TM DNA 提取試劑盒提取牛蜱DNA 后置于-80 ℃保存待用。

2.3 rDNA ITS1、ITS2 基因擴增及測序 PCR 擴增牛蜱核糖體DNA 的ITS 基因，PCR 擴增體系25 μL：Taq Plus 酶 （5 U/μL）0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，dNTPs（10 mM）2 μL，MgCl2（25 mM）2 μL，上游引物（50 pmol/μL）0.5 μL，下游引物 （50 pmol/μL）0.5 μL， 模板 DNA 1 μL，ddH2O16 μL。PCR 反應條件為：95 ℃、5 min，35 個循環， 每個循環95 ℃、45 s，55 ℃、1 min，72 ℃、90 s，最后72 ℃、5 min。 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后， 根據克隆連接試劑盒篩選陽性克隆產物， 由北京擎科生物科技有限公司進行基因測序。

2.4 rDNA ITS1、ITS2 基因序列分析 應用DNAMAN 5.2.9 Demo version 獲得校正的完整序列，在NCBI 的blast 上進行相似性搜索， 下載同源性最高的序列，應用DNASTAR.Lasergene.v7 程序中的MegAlign 軟件與獲得的序列進行多序列比較（multiple aligment），確定牛蜱的種屬，從ALIGN MENU 選擇Jotun Hein Method 分析序列差異。 應用MEGA 7.0軟件，選用Neighbor joining（NJ）鄰位歸并法制作進化樹（Phylogenetic trees），選 擇Bootstrap method 分析進行1 000 個重復驗證系統發育樹的可靠性。

3 結果與分析

3.1 牛蜱rDNA ITS 基因PCR 擴增結果 以提取的牛蜱基因組DNA 為模板進行ITS1、ITS2 基因擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結果表明，1、2 為ITS1 擴增片段，3、4 為ITS2 擴增片段， 條帶單一明亮（見圖1），陰性對照無電泳條帶出現。

3.2 牛蜱rDNA ITS 基因測序結果 PCR 擴增產物切膠純化后， 根據克隆連接試劑盒篩選陽性克隆產物， 經北京擎科生物科技有限公司進行基因測序并拼接后，獲得長度為1 982 bp 的ITS1基因序列片段、1 414 bp 的ITS2 基因序列片段，測序結果與GenBank 數據庫中蜱ITS 基因序列完全匹配。

圖1 牛蜱ITS 基因PCR 鑒定

3.3 牛蜱rDNA ITS1、ITS2 基因序列分析 將福建省龍巖地區某牛場牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列在NCBI 的blast 上進行相似性搜索，比對后相似性最高的序列以確定種， 下載國內報道主要牛蜱的ITS 基因序列等作為參考序列， 應用MEGA 7.0 軟件，選用Neighbor joining（NJ）鄰位歸并法分別構建ITS1、ITS2 基因序列的種系發育進化樹。 結果顯示，所分離的牛蜱ITS1 序列與中國甘肅2016 年上傳的微 小 扇頭蜱 （Rh.microplus） 序列（JQ737125.1、JQ737124.1）相似性達99.32%，與中國湖南2019 年上傳的微小扇頭蜱HAI2、LD2、LD5、SY1 分離株（Rh.microplus） 序列（MK224531.1、MK224539.1、MK224542.1、MK224543.1） 相似性達99.16%；ITS2序列與中國河南2016 年上傳的微小扇頭蜱（Rh.microplus）序列（KX450287）相似性達100%，與南非豪登2017 年上傳的微小扇頭蜱 （Rh.microplus） 序列（KY457506.1）相似性達100%。 種系發育分析結果顯示， 龍巖地區牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列與扇頭蜱屬（Rhipicephalus）的ITS 基因序列聚類，與革蜱屬（Dermacentor）、璃眼蜱屬（Hyalomma）處于兩個不同的分支（見圖2-圖3）。 結果表明，中國福建龍巖牛體表分離的牛蜱為微小扇頭蜱。

4 討論與結論

1）微小扇頭蜱（Rh. microplus）歸類于硬蜱科、扇頭蜱屬，呈流行性分布于世界各地[5-6]，我國華南區包括臺灣和海南全部，福建東南部，廣東、廣西中南部等地，熱帶-亞熱帶特征突出，該區域蜱類極為豐富，鐮形扇頭蜱、微小牛蜱等扇頭蜱屬為該區的廣布種[7]。微小扇頭蜱作為一宿主蜱，其主要宿主為牛。其卵在外界環境中孵化為幼蜱后便寄生于宿主上，發育期經歷若蜱、成蜱階段，雌蜱飽血后便會離開宿主在外界環境中產卵，也是許多真菌、動物原蟲、病毒以及細菌的傳播媒介和貯存宿主[8]。 微小扇頭蜱的寄生不僅導致患病動物皮膚痛癢、 肉乳品質和數量下降， 也可傳播多種病原， 如柯契卡弗朗斯蟲（Francaiella colchica）、牛邊緣邊蟲（Bovine Anaplasmosis）、牛雙芽巴貝斯焦蟲（Babesia bigemica）、瑟氏泰勒蟲 （Theileria sergenti） 和牛巴貝斯蟲（Babesia bovis）等威脅牛體健康的血液寄生蟲，給全世界范圍的畜牧業都造成嚴重的經濟損失[9]，而且會引起地方性人畜共患病。據相關報道，微小扇頭蜱可通過傳播立克次體（Rickettsia）引發斑點熱、傳播伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）引發萊姆病，威脅人類健康[10]。還可傳播內羅畢綿羊?。∟airobi sheep disease）和無漿體病。

圖2 牛蜱核糖體ITS1 基因系統進化樹

圖3 牛蜱核糖體ITS2 基因系統進化樹

2）核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA（rRNA）的基因，在真核生物中以串聯多拷貝的形式組成龐大的多基因家族， 每一單位都包括NTS、ETS、18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS2、28S rDNA[11]。rDNA 為串狀重復序列， 包括編碼區18S、5.8S 和28S rDNA 的基因， 其間的間隔區包括ITS1 及ITS2非編碼區。 由于ITS1、ITS2 基因不受選擇壓力的影響，因而種內具有高度保守性。在真核生物中，rDNA的ITS 序列進化速度是非常迅速的， 因此種間的變異較大且具多態性。 ITS 序列所表現出的這些特性，為獸醫寄生蟲學的生物多樣性分析、系統發育分析、分子分類學研究、 進化關系研究以及種屬鑒定等提供了理想標記[12]。 張新高等[13]對廣州動物園采集的華南虎絳蟲的rDNA 進行序列分析后認為， 分離的絳蟲屬于迭宮屬的猬迭宮絳蟲。 ZHU X Q 等[14]對中國源以及歐洲源的異尖線蟲基于rDNA 的ITS-1 及ITS-2 序列PCR 擴增方法進行分子鑒定，結果證明rDNA 的ITS 是一種理想的分子遺傳標記，能夠有效區分、 鑒別不同種屬及來源的異尖線蟲。 ZHU X Q等[14]選擇rDNA 的5.8S DNA 和ITS1、ITS2 做分子遺傳標記， 經PCR-RFLP 技術和PCR-SSCP 技術，證實這兩種分子標記技術均能有效區分犬首弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲。 PRASAD P K 等[15]對布氏姜片吸蟲rDNA 基于ITS 區域序列進行測序分析，證明布氏姜片吸蟲rDNA 的ITS 序列及其組成不因其發育階段不同而存在差異，具有高度保守性，進一步證明rDNA 的ITS 區域是一種有效的分子遺傳標記。目前可見許多關于應用ITS 序列作為分子標記進行蜱蟲鑒別的相關報道[16-17]。 與傳統形態學相比，分子生物學鑒定不但簡單快速， 且對于蜱類的分類研究更加準確，更利于我國對蜱種的分類鑒定、進化關系及生物多樣性研究[18]。

3）采集福建龍巖地區某牛場牛蜱樣本，設計特異性引物，對牛體表分離獲得的牛蜱核糖體DNA 的ITS1 和ITS2 基因序列進行PCR 擴增， 將擴增產物連接pMD18-T 載體后測序， 通過與GenBank 已發表的國內外蜱蟲基因序列進行比對， 結合核酸測序分析，從而確定其分類地位。 結果表明，龍巖地區分離的牛蜱為微小扇頭蜱，ITS1 序列與國內甘肅、湖南的微小扇頭蜱同源性均達到99%以上， 其中1%微小的差異可能是由于種內遺傳的多態性所致或者試驗過程測序反應中堿基的錯配；ITS2 序列與南非豪登、中國河南的微小扇頭蜱同源性均達100%。 種系發育分析結果顯示， 龍巖地區牛體表分離的牛蜱ITS 基因序列與扇頭蜱屬ITS 基因序列聚類，與革蜱屬、璃眼蜱屬處于兩個不同的分支。本項研究結果為蜱蟲的進一步分類、 鑒定和進化關系研究提供科學依據。