纈沙坦對高糖誘導大鼠腎小球系膜細胞活性損傷的干預作用

蔡承敏何玉茂余亞東

(九江市中醫醫院, 江西 九江 332000)

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一。 它已經成為終末期腎病發展的主要危險因素[1]。 但是,糖尿病腎病的發病機理尚未完全確定,并且尚無用于預防和治療糖尿病腎病發生的藥物,這已成為世界范圍內公共衛生的負擔。 最近,腎小球系膜細胞功能障礙已被證明在糖尿病腎病的發病機制中起著至關重要的作用[2]。 纈沙坦(valsartan, Val)是血管緊張素II 受體拮抗劑抗高血壓類藥物,對糖尿病大鼠足細胞損傷具有顯著的保護作用[3],通過上調骨形態發生蛋白-7(BMP-7)的表達發揮保護糖尿病腎病的功能[4]。在糖尿病小鼠腎小球組織中,纈沙坦影響NOTCH1信號通路表達[5]。 盡管纈沙坦的臨床使用有所增加,但其對糖尿病腎病治療作用的潛在機制仍不清楚,需要進一步研究。 作為高度保守的信號調節劑,NOTCH 信號通路在諸如細胞增殖,分化,凋亡和成熟等生理過程中起著重要作用[6]。NOTCH1 蛋白是NOTCH1 蛋白家族中具有代表性的受體,其下游細胞內結構域被認為是治療各種腎疾病的關鍵靶標[7]。 根據上述研究結果,推測纈沙坦對糖尿病腎病治療作用與NOTCH1 信號傳導途徑有關。 因此,當前的研究建立了高葡萄糖(HG)誘導的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 損傷模型,模擬糖尿病腎病來對細胞增殖、周期和凋亡進行評估,采用不同濃度纈沙坦干預細胞,并結合NOTCH1 信號通路,以確定纈沙坦對糖尿病腎病治療作用的潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 購自美國模式培養物保存中心(ATCC)。

1.2 主要試劑

纈沙坦購自北京諾華制藥公司,Dulbecco's modified eagle medium(DMEM 培養基)購自美國Gibco 公司；NOTCH1 信號通路激活劑Jagged 1/Fc融合蛋白購自于美國R＆D System 公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購自上海君瑞生物公司；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自美國Sigma 公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質分析試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；兔抗細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體、兔抗活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)抗體、兔抗Bcl-2 相關X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、兔抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)抗體、兔抗jagged1 抗體、兔抗NOTCH1 抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗購自上海艾博抗公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養,并置于飽和濕潤、37℃、5% CO2的培養箱中生長。

1.3.2 細胞分組與處理

將HBZY-1 分為NC 組(即對照組,未處理的細胞),HG 組(即模型組,30 mmol/L 葡萄糖處理細胞48 h),Val 1 μmol/L 組(1 μmol/L 纈沙坦處理細胞48 h),HG+Val 0.01 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和0.01 μmol/L 纈沙坦處理細胞48 h[8]),HG+Val 0.1 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和0.1 μmol/L 纈沙坦處理細胞48 h),HG+Val 1 μmol/L 組(30 mmol/L 葡萄糖和1 μmol/L 纈沙坦處理細胞48 h),HG+Val+PBS 組(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L纈沙坦和與激活劑等量的PBS 處理細胞48 h),HG+Val+ Jagged 1/Fc 組(30 mmol/L 葡萄糖、0.01 μmol/L 纈沙坦和終濃度為2 μg/mL NOTCH1 信號通路激活劑Jagged 1/Fc 融合蛋白處理細胞48 h[9])。 其中,纈沙坦使用培養基配制出0.01、0.1、1 μmol/L 的濃度。

1.3.3 Western blot 檢測CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1 和NOTCH1 的表達

收集不同處理的HBZY-1,在RIPA 緩沖液中進行蛋白的抽提。 使用BCA 蛋白質分析試劑盒對蛋白定量。 然后取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳。蛋白分離后,轉至聚偏二氟乙烯膜,然后用5%脫脂奶粉封閉膜2 h。 隨后將膜與Ⅰ抗在4℃孵育過夜,并與HRP 標記的Ⅱ抗(1 ∶5000)室溫孵育2 h。 Ⅰ抗包括抗CyclinD1、Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、jagged1、NOTCH1(均為1 ∶1000 稀釋)和抗β 肌動蛋白(β-actin)(1 ∶2000 稀釋)。 通過增強的化學發光系統顯影、曝光。 以β-actin 為對照,采用凝膠成像分析各蛋白的表達水平。

1.3.4 MTT 比色法檢測細胞增殖活力

各組HBZY-1 經不同的處理后,分別在96 孔板中接種24 h、48 h 和72 h。 接下來,每孔細胞中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液,并繼續孵育。 4 h 后,加入200 μL 的二甲基亞砜充分溶解反應結晶。 在Bio Tek 酶標儀讀取450 nm 的吸光度,以實驗組與對照組吸光度的比值表示細胞的增殖活力。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞周期與凋亡

各組HBZY-1 經不同的處理后,根據細胞周期檢測試劑盒的指示,收集1×105個細胞,經70%冷乙醇固定后,加入500 μL PI/RNase A 染色工作液,避光孵育30 ～60 min,于流式細胞儀檢測波長488 nm 處的紅色熒光,分析細胞周期。 遵循Annexin VFITC/PI 試劑盒的規程,HBZY-1 使用binding buffer重懸,收集1×105個細胞,加入5 μL Annexin VFITC 混勻和5 μL PI 工作液混勻,之后遮光反應15 min,通過FACSCalibur 流式細胞儀評估細胞凋亡。

1.4 統計學方法

數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計與分析,計量資料表示為平均數±標準差()。 兩組間數據比較采用t檢驗,多組間數據比較用單因素方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗,P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 纈沙坦促進高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 增殖

MTT 檢測結果見圖1。 與NC 組相比較,Val 1 μmol/L 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 24 h、48 h和72 h 的增殖活力無顯著變化(P＞0.05),而HG 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的增殖活力明顯降低(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組HBZY-1 24 h、48 h 和72 h 的細胞增殖活力顯著升高,且呈濃度依賴性(P＜0.05)。

2.2 纈沙坦促進高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 細胞周期

Western blot 和流式細胞術檢測結果見圖2。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1中CyclinD1 蛋白表達顯著降低,G0-G1 期細胞比例明顯增加,S 期細胞比例顯著減少(P＜0.05),G2-M期細胞比例無明顯變化(P＞0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L組和HG+Val 1 μmol/L 組HBZY-1 的CyclinD1 蛋白表達和S 期細胞比例顯著升高,G0-G1 期細胞比例明顯降低,且呈濃度依賴性(P＜0.05),同時,G2-M期細胞比例無顯著變化(P＞0.05)。

圖1 纈沙坦促進高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 增殖Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 1 Valsartan promoted the proliferation of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 after high glucose treatment

圖2 纈沙坦促進高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1(48 h)細胞周期和CyclinD1 蛋白的表達Note.A, Flow cytometry to detect the cell cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1.B, Western blot to detect the expression of CyclinD1 protein.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 2 Valsartan promoted the cell cycle and CyclinD1 protein expression in rat glomerular mesangial cells HBZY-1 (48 h) treated with high glucose

2.3 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 凋亡

Western blot 檢測和流式細胞術檢測結果見圖3。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達水平明顯增加,Bcl-2 蛋白表達水平顯著減少,細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達水平顯著降低,Bcl-2 蛋白表達水平明顯升高,細胞凋亡率顯著減少,均呈濃度依賴性(P＜0.05)。

2.4 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 NOTCH1 信號通路

Western blot 檢測結果見圖4。 與NC 組相比較,HG 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 中jagged1和NOTCH1 蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)。 與HG 組相比較,HG+Val 0.01 μmol/L 組、HG+Val 0.1 μmol/L 組和HG+Val 1 μmol/L 組jagged1 和NOTCH1 蛋白表達水平明顯降低,且呈濃度依賴性(P＜0.05)。

圖3 纈沙坦抑制高糖處理大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 凋亡Note.A, Western blot detection of valsartan inhibits the expression of HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in rat glomerular mesangial cells treated with high glucose for 48 h.B, flow cytometry detection of rat kidney HBZY-1 apoptosis of mesangial cells.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 3 Valsartan inhibited the apoptosis of HBZY-1 glomerular mesangial cells in rats treated with high glucose

2.5 NOTCH1 信號通路激活劑部分逆轉纈沙坦對高糖處理的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 的增殖和細胞周期的影響

Western blot 檢測、MTT 檢測和流式細胞術檢測結果見圖5。 與HG+Val+PBS 組相比較,HG+Val+Jagged 1/Fc 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 的NOTCH1、jagged1 蛋白表達水平明顯升高,CyclinD1蛋白表達水平降低,且24 h、48 h 和72 h 的細胞增殖活力明顯降低,G0-G1 期細胞比例顯著增加,S 期細胞比例明顯減少(P＜0.05),G2-M 期細胞比例無顯著變化(P＞0.05)。

2.6 NOTCH1 信號通路激活劑部分逆轉纈沙坦對高糖處理的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 凋亡的影響

Western blot 檢測和流式細胞術檢測結果見圖6。 與HG+Val+PBS 組 相 比 較,HG+Val+Jagged 1/Fc 組大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 的Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達水平升高,Bcl-2蛋白表達水平降低, 且細胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

圖4 Western blot 檢測大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 jagged1 和NOTCH1 蛋白的表達Note.Compared with NC group, *P＜0.05.Compared with HG group, #P＜0.05.Figure 4 Western blot detected the expression of HBZY-1 jagged1 and NOTCH1 proteins in rat glomerular mesangial cells

臨床上,糖尿病腎病具有多種癥狀特征,例如蛋白尿。 作為腎小球的固有細胞之一,腎小球系膜細胞在糖尿病腎病的發病機理中發揮著重要的作用[9]。 越來越多的證據已經確認,腎小球系膜細胞凋亡有助于蛋白尿的加重和糖尿病性腎小球硬化的發展[10]。 因此,確定導致腎小球系膜細胞凋亡的可能機制對于深入了解糖尿病腎病的發病機理是十分必要的。 本研究實驗結果表明,大鼠腎小球系膜細胞暴露于高糖條件下可導致細胞增殖減少,阻滯細胞周期,且細胞凋亡增加[11]。 而纈沙坦的處理可以減輕高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞損傷,并且,可以抑制高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞中NOTCH1 信號通路活性,證明了纈沙坦在預防或治療糖尿病腎病方面的潛力。

纈沙坦是臨床常用的降血壓藥物,此外,其在糖尿病腎病中的功能得到了廣泛關注。 各種研究已經證明,纈沙坦可以保護高糖刺激的腎小球足細胞或系膜細胞損傷,產生治療糖尿病腎病的功效[12-13]。 目前的研究評估了纈沙坦在高糖損傷大鼠腎小球系膜細胞中的作用。 與HG 模型組相比,0.01、0.1、1 μmol/L 纈沙坦干預細胞48 h 后,細胞的增殖活力、S 期細胞比例、細胞增殖相關蛋白CyclinD1 蛋白表達明顯增強,G0-G1 期細胞比例、細胞的凋亡率、促凋亡蛋白Bax、凋亡執行蛋白酶Cleaved caspase-3 蛋白表達顯著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著提高。 當前研究的結果表明,纈沙坦對高糖誘導大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 損傷表現出治療作用。 值得注意的是,纈沙坦的濃度越高,其治療效果越顯著。

圖5 NOTCH1 信號通路激活劑部分逆轉纈沙坦對高糖處理的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 的增殖和周期的影響Note.A,MTT detection of cell proliferation activity.B,Western blot detection of rat mesangial HBZY-1 jagged1,NOTCH1,CyclinD1 protein expression.C, Flow cytometry detection of rat mesangial cells HBZY-1 cell cycle.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 5 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the proliferation and cycle of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

圖6 NOTCH1 信號通路激活劑部分逆轉纈沙坦對高糖處理的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 凋亡的影響Note.A, Flow cytometry to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 apoptosis.B, Western blot to detect rat glomerular mesangial cells HBZY-1 Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression.Compared with the HG+Val+PBS group, *P＜0.05.Figure 6 The NOTCH1 signaling pathway activator partially reversed the effect of valsartan on the apoptosis of rat glomerular mesangial cells HBZY-1 treated with high glucose

NOTCH 信號通路在維持進化過程中起著高度保守的信號調節系統的作用,并在細胞的正常增殖和分化中發揮重要作用。 在脊椎動物中,配體(Delta-like 或Jagged 蛋白)激活跨膜受體NOTCH1-4。 激活后,NOTCH 細胞內結構域(NICD)的切割允許其易位至細胞核,從而通過途徑核效應子RBPJ激活目標基因,例如HES bHLH 轉錄因子[14]。 該通路的失調與多種疾病有關,包括糖尿病腎病。 越來越多的研究檢測到,糖尿病腎病中NOTCH1 信號傳導途徑轉導的異常激活[15]。 在糖尿病腎病的病理過程中,高血糖和血液動力學改變會誘導NOTCH信號通路的jagged1 配體和NOTCH1 受體表達增加,從而導致受體結構發生改變[16]。 一些研究已證明,阻斷NOTCH1 信號傳導途徑對糖尿病腎病是一種有效的治療策略[17]。 本研究表明,不同濃度的纈沙坦均可抑制高糖誘導的NOTCH1 信號通路活性,降低jagged1、NOTCH1 蛋白表達,并呈濃度依賴性,與文獻[5]報道的纈沙坦降低糖尿病小鼠腎小球組織中jagged1、Notch1 表達的結果相同。 進一步的研究發現,NOTCH1 信號通路激活劑Jagged 1/Fc 融合蛋白處理細胞后,纈沙坦對高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1 增殖、周期的促進作用被部分逆轉,其對細胞凋亡的抑制作用也被部分逆轉。 由此可見,纈沙坦可以保護大鼠腎小球系膜細胞免受高糖誘導的損傷,其潛在機制是通過抑制NOTCH1 傳導途徑來實現的。

綜上所述,0.01、0.1、1 μmol/L 濃度的纈沙坦可以濃度依賴性的促進高糖誘導的大鼠腎小球系膜細胞增殖和周期,并抑制期凋亡,其發揮保護作用的機制與抑制NOTCH1 信號通路活性有關,這為糖尿病腎病治療藥物的開發提供了新的途徑和依據。