五指毛桃組織培養快繁體系的研究

陳英之 ，霍秀意 ，歐陽蒲月 ，2，甘鳳瓊 ，李良波 ，黃榮韶

（1.廣西大學農學院，南寧 530004；2.廣東食品藥品職業學院，廣州 510520；3.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530200）

五指毛桃（Ficushirtavahl）又稱為五指牛奶、粗葉榕、土北芪及五爪龍等，是桑科榕屬植物，具有活絡舒筋、補肺健脾和行氣利濕等功效，用于肺癆咳嗽、脾虛浮腫、盜汗、食少無力、月經不調、帶下、水腫、產后無乳、風濕痹痛等癥［1-3］。作為珍貴的藥用植物資源，五指毛桃是多種中成藥的原料，已廣泛應用于臨床治療上。此外，五指毛桃還是藥食同源的植物，可以制成一些湯料、保健飲品、速溶粉等保健產品。

近年來，對五指毛桃的報道主要集中在品種的考證、化學成分分析、藥理活性等方面。組織培養方面，蔣林等［4］以五指毛桃莖節為外植體進行離體再生研究，黃賽等［5］以頂芽為外植體進行芽增殖培養研究。蘇鈺琴［6］以五指毛桃莖尖外植體，進行了初代培養、繼代培養和生根培養試驗。李林軒等［7］以葉片作為外植體，進行不同激素對比研究。陶瑜等［8］以新鮮五指毛桃種子為試驗材料，比較了6-BA、NAA及2，4-表油菜素內酯（2，4-EBL）對其愈傷組織的誘導率及根發生率的影響。本試驗通過在培養基中添加不同的細胞分裂素和生長素誘導五指毛桃種子萌發，以種子萌發率、不定芽增殖倍數、生根率、移栽成活率及組培苗的生長情況為指標來確定適合五指毛桃繁殖的培養基配方和移栽基質，建立五指毛桃組織培養快繁體系，為大規模生產、保護五指毛桃的種質資源、緩解五指毛桃供不應求的市場壓力，同時為五指毛桃產業發展提供技術支撐；解決五指毛桃資源短缺制約產業發展的問題，實現對種質資源的優化和快速利用。

1 材料與方法

1.1 材料

五指毛桃種子采自廣西南寧市邕寧區那樓鎮廣澤健康產業種植基地。將無病蟲害、生長健壯且成熟的五指毛桃果實搓爛果肉，取出種子。

1.2 方法

1.2.1 種子處理 在超凈工作臺上，先用無菌水浸洗五指毛桃種子2次，每次浸洗2～3 min，浸洗時輕輕搖晃，再用75%乙醇浸洗30 s，無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%HgCl2消毒12 min，用無菌水沖洗4次，置于無菌濾紙中晾干水分，接入培養基中。

1.2.2 接種 將消毒好的種子接入5種不同的培養基：以MS為培養基的基礎上，分別添加不同濃度的椰汁（0%、10%、20%）、不添加椰汁且將MS的量減半、10%的椰汁+6-BA1.5+NAA0.2。培養基中均添加20 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂，pH調為5.8～6.0；培養基分裝后，于121℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min。

每瓶培養基接種5粒種子，在培養基上均勻分布，每個處理設2次重復。置于培養室中培養，培養室條件：溫度25℃，日光燈照明，光照時間12 h/d，光照度為1 500～2 000 lx。每隔3 d觀察1次，統計種子的萌發率和觀察種苗的長勢。

1.2.3 增殖培養 選取長勢較好的五指毛桃種子萌發無菌苗，在超凈工作臺上用無菌手術刀將其切成1～2 cm的帶腋芽的莖段，接種到不同的培養基配方中。

以MS為培養基的基礎上，不添加任何植物生長調節劑、添加不同濃度的細胞分裂素6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和 NAA（0.3、0.6 mg/L）進行雙因素試驗，篩選出適合五指毛桃繁殖的培養基配方。每個處理5瓶，每瓶5個單芽。接種后置于培養室中培養，每隔3 d觀察1次，統計組培瓶內五指毛桃的增殖芽數、觀察苗的生長情況。

1.2.4 生根培養 選取生長良好的繼代苗，剪成帶腋芽的莖段或單芽，轉入生根培養基。生根培養以1/2MS為培養基的基礎上，不添加任何植物生長調節劑、添加0.3 mg/L NAA和不同濃度的IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L）。每種處理接4瓶，每瓶5顆苗。接種后置于培養室中培養，每隔3 d觀察1次，統計組培瓶內五指毛桃的生根率及根條數，觀察各處理間組培苗的生長情況。

1.2.5 移栽試驗 不同移栽基質以及組培苗在前期無菌條件下的生長情況影響著其成活率，為篩選出適合組培苗生長的基質，本試驗將莖高達5～6 cm且具有4～5條根的組培苗移栽至6種經121℃滅菌30 min不同的基質（珍珠巖、蛭石、育苗基質、育苗基質∶珍珠巖（1∶1）、育苗基質∶蛭石（1∶1）、珍珠巖∶育苗基質∶蛭石（1∶1∶1）中，每種處理裝10杯，每杯1株苗，比較移栽后苗的成活率和苗的生長情況。

2 結果與分析

2.1 無菌苗的培養

不同配方培養基對五指毛桃無菌種子萌發的影響結果見表1，種子萌發后的生長情況如圖1所示。結合表1和圖1可以看出，種子萌發率最高的培養基為處理1、處理2、處理3，萌發率均為70%，苗長勢最好的培養基為處理2（即1/2MS）；加入椰汁反而不利于種子萌發，當增加椰汁濃度時，種子的萌發率降低；同時加入椰汁、6-BA和NAA兩種植物生長調節劑時，種子的萌發率最低，只有30%。由此可知，1/2 MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃種子萌發最適的培養基。

表1 培養基對五指毛桃種子萌發的影響

2.2 繼代培養

不同處理間的增殖倍數和苗的生長情況見表2和表3，不同濃度的細胞分裂素和生長素所培養出來的五指毛桃組培苗的增殖情況如圖2所示。結合表2和表3及圖2可以看出，不添加任何植物生長調節劑時，五指毛桃的增殖倍數最高，可達到3.40；添加植物生長調節劑的情況下，當添加細胞分裂素6-BA 0.5 mg/L、生長素NAA 0.3 mg/L時芽增殖最多，增殖倍數為3.04；通過方差分析可知，NAA對五指毛桃增殖培養的重要性大于6-BA，6-BA不同濃度水平間的差異顯著，NAA不同濃度水平間的差異極顯著，而6-BA和NAA兩種植物生長調節劑的交互作用對五指毛桃的增殖培養差異不顯著。當6-BA的濃度不變，NAA濃度增加時，增殖倍數降低，且苗的長勢較弱；當NAA的濃度不變，6-BA濃度增加時，增殖倍數也降低，但是降低的幅度相對較小，NAA的濃度變化對苗的增殖和長勢影響較顯著。當NAA濃度為0.6 mg/L時，愈傷組織較多，且苗出現褐化現象。由此可知，MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃增殖最適的培養基，高濃度的6-BA和NAA不適合五指毛桃的增殖培養。

圖1 五指毛桃種子在不同培養基中的生長情況比較

表2 不同濃度的生長調節劑組合對五指毛桃組培苗增殖的影響

表3 不同培養基增殖培養方差分析

圖2 不同培養基配方五指毛桃的增殖比較

2.3 生根培養

不同濃度的IBA對五指毛桃組培苗影響結果見表4和表5，生根情況如圖3所示。結合表4、表5和圖3可以看出，不添加任何植物生長調節劑（即1/2MS）的生根率最高，達到100%，其組培苗的長勢也是最好的。當添加IBA和NAA時，增加IBA的濃度，生根率降低，且苗長勢也會隨IBA濃度的增大而變差。通過方差分析可知，IBA不同濃度水平對五指毛桃生根的影響差異顯著，各處理的重復間無顯著的差異性。由此可知，1/2MS+20 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為五指毛桃生根最適的培養基，生根率達100%。

2.4 移栽

取莖高達5～6 cm且有4～5條根的組培苗（圖4）移栽至不同的基質中。五指毛桃組培苗成活率結果見表6，五指毛桃組培苗移栽第1天和移栽后30 d苗的生長情況見圖5和圖6。結合圖5和表6可以看出，五指毛桃成活率最高的移栽基質為珍珠巖，高達90%；成活率最低的基質為育苗基質；在育苗基質∶蛭石（1∶1）的移栽基質中，苗的長勢最好。綜合苗的質量情況，最適合五指毛桃移栽的基質為育苗基質：蛭石（1∶1）。

表4 不同濃度的IBA對五指毛桃生根的影響

表5 生根培養基平均生根數的方差分析

圖3 不同濃度的IBA對五指毛桃生根的影響

表6 不同移栽基質五指毛桃成活率

圖4 移栽前的組培苗

圖5 移栽第1天的組培苗

圖6 移栽后30 d五指毛桃的生長情況比較

3 討論

3.1 培養基添加物對五指毛桃種子萌發的影響

前人在植物組織培養的實踐過程中發現，在培養基中添加一些適宜的天然附加物可以促進培養物的生長發育，常用的附加物有椰汁、番茄汁、土豆汁和香蕉泥等［9］。天然的椰汁中含有豐富的營養，在植物組織培養中得到了廣泛的應用。

王楷等［10］研究表明，在培養基中添加10%的椰汁能提高白芨種子的萌發率，對原球莖的生長起到促進作用。孫玉芬［11］對蘭屬雜交種子無菌播種的試驗研究發現，添加椰汁對種子萌發的效果反而較不添加的效果差。

本試驗結果與王楷等［10］的研究結果不同，與孫玉芬［11］的研究結果相似。添加椰汁不利于五指毛桃種子的萌發，分析原因可能是椰汁對五指毛桃種子萌發無促進作用，過高濃度的椰汁抑制種子的萌發；也可能與椰汁中含有一些激素、氨基酸及酶等營養物質有關。

3.2 五指毛桃增殖培養組培苗的褐化現象

在植物組織培養過程中，許多組培苗會產生酚類物質，導致褐化現象的產生，木本植物的褐變現象較嚴重［12］。褐化現象不僅與植物自身有關，而且還與外植體的處理、培養條件及植物激素的使用等有關［13，14］。

蔣林等［4］進行探討發現，影響五指毛桃褐變的因素包括培養環境的光照與溫度條件、培養基的成分及植物體內的酚類物質。本試驗結果表明，五指毛桃組培苗出現褐化現象可能與培養基中NAA的濃度有關，還可能與不同激素濃度影響著五指毛桃產生酚類物質的程度有關，試驗結果與蔣林等［4］對五指毛桃組織培養中褐變的原因探討結果相似。

3.3 IBA和NAA對五指毛桃生根的影響

IBA能促進細胞分化、根系增多及伸長［15］，NAA可以促進細胞分裂和擴大，兩種激素對五指毛桃的生根都有顯著影響。在生根培養過程中，可單獨使用IBA或NAA，也可兩種激素同時配合使用，不同激素配比及濃度得到的生根效果不同。

本試驗結果顯示，同時添加IBA和NAA對五指毛桃生根的效果較不添加時的效果差，當不添加IBA和NAA時，五指毛桃組培苗的生根率最高，與李林軒等［7］報道的誘導五指毛桃生根最適培養基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA的結果不同。尹明華等［16］對黃獨試管苗進行生根研究表明，適當濃度的NAA能促進生根；付文奇等［17］研究東方百合幼苗的根系生長，適宜的NAA和IBA配比能提高根系的活力，促進生長。本試驗中，IBA和NAA對五指毛桃的生根未表現出促進作用。這可能與本試驗設計的激素濃度范圍不適合五指毛桃生根相關；也可能與五指毛桃自身在生長過程中產生的內源激素與所添加的外源激素相互作用有關。

3.4 不同基質對五指毛桃移栽的影響

移栽試驗是檢驗組培苗能否適應田間環境的途徑，而移栽成活率的高低又決定著組培苗能否實現產業化，不同移栽基質的移栽效果不同。李林軒等［7］研究結果顯示，泥炭∶珍珠巖（1∶1）是五指毛桃移栽最好的基質，本試驗結果與其研究結果有差異。本試驗結果中，珍珠巖中五指毛桃的成活率最高，可能與珍珠巖的通氣性好、雜菌極少有關；其苗的長勢不佳，可能與珍珠巖中無養分有關。

在五指毛桃快速繁殖中以種子為外植體，在MS培養基上培養，不添加任何激素，就可以生長發育為帶根的可移栽的幼苗，大大縮短了五指毛桃組培苗的培育時長，提高了快速繁殖的效率，為五指毛桃快繁體系的建立提供了新途徑。