芹菜素激活TRAIL死亡受體參與誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡的實驗研究

崔昭陽，李素娜，姜旭倩，王弈丹，侯麗穎，

(1．華北理工大學公共衛生學院，河北 唐山063210；2．華北理工大學理學院，河北 唐山063210)

胃癌是當今世界最常見的消化系統惡性腫瘤之一，在診斷和治療中存在早期不易發現、術后預后不良等難題，而且化療藥物容易產生毒副作用和耐藥性，因此研發新的藥物以尋求胃癌的有效治療具有重要意義。芹菜素(apigenin，API)別名芹黃素，是一種從植物中提取的黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類及茶葉中，以芹菜中含量最高，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌以及抗病毒等藥理作用。近年來已有大量研究顯示API在多種腫瘤細胞系中均具有抗腫瘤作用，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌和白血病等，API作為一種潛在的腫瘤化學預防、治療劑已引起廣泛的關注。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)作為腫瘤壞死因子超家族成員之一，主要通過外源性信號通路參與腫瘤細胞凋亡的誘導。TRAIL與細胞膜上的死亡受體DR4、DR5特異性結合可將凋亡誘導信號傳導至細胞內部引起后續的凋亡級聯反應。本研究用中度分化的人胃癌SGC-7901細胞作為體外腫瘤模型，明確API對細胞增殖和凋亡的影響，進一步探討TRAIL死亡受體是否參與了API誘導的細胞凋亡過程，旨在闡明API抗腫瘤作用的部分機制，為胃癌的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和藥物處理

實驗選用的人胃癌SGC-7901細胞來源于上海腫瘤研究所，保存在-80℃冰箱中。培養細胞使用含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI-1640完全培養液。于37℃、CO體積分數為5%的恒溫培養箱中常規培養細胞，取對數生長期的細胞進行實驗。

API用二甲基亞砜(DMSO)溶解成50 mmol/L的儲備液，過濾除菌，4℃避光保存，使用時用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋至終濃度，0.1%DMSO處理組作為對照組。

1.2 主要試劑

API購自Sigma公司，CCK-8購自莊盟生物公司，FITC-Annexin V凋亡試劑盒購自BD公司，BCA蛋白定量試劑盒購自EpiZyme Scientific公司，抗兔DR4一抗購自Abcam公司，抗兔DR5一抗、β-actin一抗均購自Cell Signaling公司，抗兔堿性磷酸酶二抗購自PROMEGA公司，DR4 siRNA、DR5 siRNA均購自Santa Cruz公司。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖情況

取生長至對數期的人胃癌SGC-7901細胞，0.25%胰蛋白酶消化，細胞計數板進行計數并用含2%胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋成細胞濃度為1×10個/mL的細胞懸液，于96孔板中按每孔100 μL進行鋪板，待底面覆蓋率達到70%～80%時，根據查閱文獻以及前期預實驗結果，設置不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組、對照組(不含API的正常細胞孔)以及空白組(僅有培養液的無細胞孔)，分別作用細胞12、24、48 h，作用結束后各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h，用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光度

D

(450)值，按下式計算各組細胞增殖率。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

常規培養細胞，按照1×10個/孔的細胞濃度于6孔板中進行鋪板，設置對照組及不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組，根據前期預實驗結果以及細胞增殖檢測結果，選擇作用細胞24 h；或在API作用細胞前，采用RNAi技術，使DR4 siRNA和DR5 siRNA轉染SGC-7901細胞18 h，抑制DR4、DR5的表達，再加入60 μmol/L API作用細胞24 h，即設置對照組、API組、DR4 siRNA+API組、DR5 siRNA+API組，作用結束后分別收集各組細胞，緩沖液調整細胞濃度至1×10個/mL，取100 μL細胞懸液分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI染料，混合后室溫下避光孵育15 min，加入400 μL緩沖液靜置5 min，流式細胞術分別檢測各組細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測DR4及DR5蛋白的表達水平

常規培養細胞，待培養皿底面覆蓋率達到70%～80%時，設置對照組及不同濃度(20、40、60、80 μmol/L)API組作用細胞24 h，收集各組細胞，PBS沖洗離心取下層沉淀重懸于細胞裂解液中，超聲破碎細胞，冰上裂解后離心取上清進行蛋白提取，BCA法測定蛋白含量，調整各組蛋白含量并與蛋白上樣緩沖液混合，-20℃貯存備用。Western blot實驗時取等量蛋白上樣，用SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，低溫轉移到PVDF膜，5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1.5 h，置于DR4、DR5一抗中4℃搖晃孵育過夜，TBST清洗3次后再置于堿性磷酸酶二抗中37℃搖晃孵育1.5 h。采用增強化學發光法顯色，數字成像儀對圖像進行拍照及分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 芹菜素對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用

CCK-8法細胞增殖檢測結果見圖1，作用12 h，20、40、60、80 μmol/L API組細胞的增殖率依次為(82.87±0.46)%、(76.50±1.63)%、(60.69±0.98)%、(55.20±1.33)%(

r

=-0.99，

F

=860.52，

P

＜0.01)。作用24 h，各組細胞增殖率分別為(63.79±6.08)%、(39.70±4.98)%、(33.29±4.65)%、(37.61±3.62)%(

r

=-0.88，

F

=120.81，

P

＜0.01)。作用48 h，各組細胞增殖率分別為(55.08±3.24)%、(16.66±0.37)%、(8.63±0.90)%、(13.07±1.10)%(

r

=-0.89，

F

=1801.15，

P

＜0.01)。可見隨著 API作用濃度的增加，細胞增殖率下降，作用12 h時在80 μmol/L處達到最大抑制率，作用24、48 h時均在60 μmol/L處達到最大抑制率，各組細胞增殖率與對照組相比差異均具有統計學意義(均為

P

＜0.01)，同時可以看出在相同的作用濃度下，細胞增殖率也隨作用時間的增加而降低。

圖1 不同濃度API作用SGC-7901細胞不同時間后的細胞增殖情況

2.2 芹菜素對人胃癌SGC-7901細胞的凋亡誘導作用

流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況的結果見圖2，對照組和20、40、60、80 μmol/L API組細胞凋亡率依次為(0.87±0.64)%、(2.17±0.51)%、(23.30±5.63)%、(54.97±2.93)%、(60.57±1.64)%。各濃度組與對照組相比差異具有統計學意義(

r

=0.96，

F

=275.99，

P

＜0.05)，提示API可誘導人胃癌SGC-7901細胞發生凋亡，且隨著作用濃度的增加，細胞凋亡率升高。

圖2 API作用SGC-7901細胞24 h后的凋亡檢測

2.3 芹菜素對人胃癌SGC-7901細胞TRAIL通路中死亡受體DR4、DR5蛋白表達的影響

Western blot檢測TRAIL通路中死亡受體DR4、DR5蛋白表達的結果見圖3。隨著API作用濃度的增加，DR4和DR5的蛋白表達水平均呈現增加趨勢，DR4蛋白表達水平在80 μmol/L處達到峰值，DR5蛋白表達水平在60 μmol/L處達到峰值。

2.4 芹菜素上調DR4、DR5表達對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

DR4 siRNA和DR5 siRNA分別沉默DR4和DR5的表達后，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況的結果見圖4，對照組、API組、DR4 siRNA+API組、DR5 siRNA+API組細胞凋亡率依次為(0.87±0.64)%、(54.97±2.93)%、(32.23±3.75)%、(29.53±0.93)%。結果表明阻斷DR4、DR5的表達后，凋亡率與API組相比明顯下降，各濃度組之間差異均具有統計學意義(

F

=246.763，

P

＜0.01)。

圖3 Western blot檢測API作用SGC-7901細胞后的DR4、DR5蛋白表達水平

圖4 沉默死亡受體DR4和DR5后對API誘導SGC-7901細胞凋亡的檢測

3 討論

胃癌是一種源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。據統計，2018年胃癌在全球的發病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第2位和第5位，嚴重威脅了人民的生命健康。惡性腫瘤最基本的生物學特征是細胞的失控性增殖，而抑制腫瘤細胞增殖是API抗腫瘤作用的重要體現之一。本研究結果表明，隨著API作用濃度的增加，細胞增殖率不斷降低，作用12 h時在80 μmol/L處達到最大抑制率，作用24、48 h時均在60 μmol/L處達到最大抑制率，可見API能抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖，同時具有濃度依賴性。孫悅等使用MTT法觀察了不同濃度API作用SGC-7901細胞24 h下的細胞增殖抑制情況，與本實驗觀察到的結果一致。劉歡等研究了 API低濃度(0～20 μmol/L)長時間(24～72 h)作用下對人胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用，本實驗繼續觀察了高濃度(80 μmol/L)API在長時間的作用下對胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制作用，補充了API對胃癌細胞增殖抑制的實驗，更加明確了API對腫瘤細胞增殖的抑制作用。

促進腫瘤細胞凋亡是API抗腫瘤作用機制研究中的重要一環。細胞凋亡是一個由基因決定的細胞主動結束生命的過程，可以清除威脅機體穩態的細胞(如腫瘤細胞等)。在本研究中，我們用不同濃度API作用細胞24 h測定胃癌細胞凋亡率發現：隨著API作用濃度的增加，細胞凋亡率逐漸增加，證明API可濃度依賴性的誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡。在一項對索拉非尼耐藥的肝細胞癌的研究中，?irin等首次發現在體外聯合應用索拉非尼和API可明顯增加肝癌細胞的凋亡，表明API在某些耐藥細胞株中也有一定凋亡誘導作用。

在目前已知的細胞凋亡信號通路中，TRAIL通路屬于死亡受體途徑。TRAIL通路最顯著的特征就是能夠選擇性殺傷腫瘤細胞而對大多數正常細胞無明顯毒性。TRAIL通路之所以具有這種特征主要是因為TRAIL的一類特異性受體：死亡受體(death receptor，DR)，包括DR4和DR5，這類受體屬于跨膜受體，在細胞內的部分含有死亡結構域(domain death，DD)功能區，與TRAIL特異性結合后就可傳導凋亡信號引起細胞凋亡。同時在受體分布上，DR4和DR5在腫瘤細胞系中較為常見，因此在TRAIL通路中的DR4、DR5受體可以特異性的誘導腫瘤細胞凋亡。本研究通過Western blot檢測了TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5蛋白表達情況，發現隨著API作用濃度的升高，DR4和DR5的蛋白表達量也逐漸增加，分別在API作用濃度為80和60 μmol/L處達到峰值，表明API可以上調TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5的蛋白表達。已有研究表明在白血病細胞中發現API可通過上調TRAIL通路中死亡受體DR5的表達增強TRAIL誘導凋亡的作用，且這種作用在正常人外周血單核細胞中未觀察到。Chen等發現在非小細胞癌中，API的存在也可同時上調死亡受體DR4和DR5的水平，并以p53依賴的方式使癌細胞對凋亡敏感。為了進一步明確DR4、DR5在API誘導的細胞凋亡中的作用，本研究用siRNA特異性沉默DR4、DR5受體，用60 μmol/L API作用細胞24 h測定凋亡率發現在沉默DR4和DR5受體后，與API組相比，DR4 siRNA+API組和DR5 siRNA+API組的細胞凋亡率均降低，因此本研究推測TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5參與了API誘導人胃癌SGC-7901凋亡的過程。在一項關于培美曲塞誘導非小細胞肺癌細胞凋亡的研究中同樣發現了使用siRNA抑制DR5表達可以減弱培美曲塞對非小細胞肺癌細胞的凋亡誘導作用。

綜上所述，本研究證實了API可抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導其發生凋亡，誘導凋亡的機制可能與激活TRAIL通路中死亡受體DR4和DR5的表達有關。本研究進一步完善了API抗腫瘤作用的機制，為新的抗腫瘤靶點提供了更多的證據支持。