基于數據庫的未分化甲狀腺癌基因組變異分析及靶向藥物篩選

王耀坤，陳玨曉，張明遠，邵長利，楊 玉，商 宇

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯 154007)

甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)是最常見的內分泌系統腫瘤。近二十年來，TC的發病率在全球范圍內快速增長。TC的發病與多種環境因素相關，包括放射因素、碘的攝入、吸煙等。未分化甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)是惡性程度最高的甲狀腺癌。ATC可以自發產生，也可以由分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)，如甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroid cancer，PTC)與甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid cancer，FTC)進展而來。ATC 發病率極低，僅占所有甲狀腺癌的2%，但是其致死率極高。因ATC死亡的病例占所有因TC死亡病例的50%以上。與DTC相比，常規的手術、放療與化療對ATC均無較好的治療效果。因此進一步發掘ATC的分子標記物，并闡明其在TC發病中的潛在作用，對于ATC患者的診斷與精準治療具有重要意義。

基因組變異是惡性腫瘤的重要特征。特有的畸變被許多腫瘤所攜帶，并能夠影響腫瘤的發生和預后。基因組變異主要包括單核苷酸變異(single nucleotide variation，SNV)、染色體結構變異與染色體區段的拷貝數變異(copy number variation，CNV)。ATC患者常攜帶各種基因組變異，如

RAS

基因突變、

BRAF

基因突變、

RET/PTC

基因重排等。鑒于ATC病因的復雜性與ATC患者的個體差異，我們對于基因變異，特別是CNV在ATC發病中的作用尚不清楚。在本研究中，我們利用在線數據庫對ATC患者的基因組變異進行分析，并篩選與患者預后關系最密切的基因變異，進而對候選變異基因進行蛋白質相互作用與靶向藥物篩選分析，旨在為ATC的惡性機制研究及潛在治療靶點篩選提供新思路。

1 對象與方法

1.1 利用cBioPortal數據庫分析ATC患者基因變異信息

cBioPortal數據庫(https://www.cbioportal.org/)整合了來自多個平臺的腫瘤基因組數據，如TCGA與ICGC等；并且提供多維度的腫瘤基因集數據，包括體細胞突變、CNV、mRNA和microRNA(miRNA)表達、DNA甲基化等數據。我們對cBioPortal數據庫中的“Poorly-Differentiated and Anaplastic Thyroid Cancers(MSKCC，JCI 2016)”項目進行研究。該項目納入了84例低分化甲狀腺癌和33例ATC樣本的數據。我們取此33例ATC樣本的數據，包括患者的相關資料、基因突變數據與CNV數據。然后通過在線繪制韋恩圖網站DrawVennDiagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選同時發生突變及CNV的基因，計算其遺傳變異頻率并排序。

1.2 分析基因變異對患者生存率的影響

從cBioPortal數據庫獲得患者的生存時間數據、基因突變數據與CNV數據。分析變異頻率最高基因的基因變異(如錯義突變與CNV)與患者生存率之間的關系。GraphPad Prism 5.0軟件被用于繪制生存曲線并進行統計分析。患者生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存率比較采用Log Rank檢驗，以

P

＜0.05表示差異有統計學意義。

1.3 利用STRING數據庫分析蛋白質相互作用并進行基因功能富集及注釋

STRING數據庫(https://string-db.org/)是在線搜索已知的蛋白質相互作用關系的數據庫。利用STRING數據庫查找靶蛋白的相互作用蛋白。“active interaction sources”設置為“Experiments”。“minimum required interaction score”設置為“0.4”。進而利用STRING數據庫的Analysis模塊，對相互作用蛋白進行GO基因生物學功能注釋。

1.4 利用CARE軟件篩選ATC潛在靶向藥物

CARE(http://care.dfci.harvard.edu/)是一款在線預測靶向治療和耐藥的調節基因的軟件。除了用于預測藥物靶向治療效果外，CARE還可以用來預測基因改變與藥物功效之間的關聯。CARE軟件的一個關鍵指數是CARE評分。對于輸入的目的基因，CARE評分的正值越高表示與藥物反應的相關性越高，而負值越低則表示與藥物耐藥相關性越高。首先將與患者生存率改變關系密切的基因輸入CARE搜索框，并選定相應的突變類型，然后根據CARE評分篩選可能有效的靶向藥物。

2 結果

2.1 TP53、PI3KCA、ARID2是ATC遺傳變異頻率最高的基因

ATC患者基因變異信息分析結果如圖1所示。通過cBioPortal數據庫中的ATC樣本數據，一共檢索到134個突變基因與11個拷貝數變異基因。對突變基因與拷貝數變異基因取交集，發現8個基因同時存在拷貝數變異與基因突變，包括

TP53

、

PI3KCA

、

ARID2

、

IL7R

、

CDKN2A

、

FAT1

、

SRC

、

ALK

。其中，

TP53

、

PI3KCA

、

ARID2

是ATC遺傳變異頻率最高的基因，其變異頻率分別為75.8%、21.2%與12%。

2.2 TP53基因的錯義突變與患者生存率下降有關

基因變異對患者生存率的影響如圖2所示。對變異頻率最高的

TP53

、

PI3KCA

與

ARID2

的各種遺傳變異與患者生存率之間的關系進行分析，我們發現14例攜帶

TP53

錯義突變的患者的生存時間均少于15個月。在9例攜帶野生型TP53的患者中，我們發現2例患者生存時間超過30個月，1例患者生存時間超過90個月。因此，

TP53

基因的錯義突變與患者生存率下降有關。由于ATC的發病率非常低，而且患者的生存時間往往較短，因此盡管結果無統計學意義(

P

=0.07)，我們仍然猜測，若增加樣本量，應該可以發現

TP53

基因的錯義突變與患者生存率下降存在關聯。除此之外，

PI3KCA

和

ARID2

基因的突變與拷貝數變異及

TP53

基因的其他變異均未發現與患者的生存率有明顯關系。

圖1 ATC患者基因變異情況分析

圖2 TP53基因錯義突變與ATC患者生存期的關系

圖3 P53相互作用蛋白及GO功能注釋

2.3 P53通過調控DNA損傷修復、細胞周期阻滯等生物學過程參與ATC的發生

利用STRING數據庫分析TP53蛋白相互作用關系，以闡明

TP53

基因在ATC發病中可能發揮的作用。結果發現，能夠直接與P53(

TP53

編碼產物)結合的 蛋 白 包 括 ： FZR1、 MDM2、 MDM4、 TP53BP1、CREBBP、 EP300、 BCL2L1、 HMGB1、 TP53BP2、RPA1(圖3A)。進一步對相互作用蛋白進行富集與生物學功能注釋。發現相互作用蛋白富集于DNA損傷修復、細胞對射線的反應、細胞凋亡的調控、細胞周期阻滯的調節等生物學過程(圖3B)。輻射暴露是甲狀腺癌的風險因素，即使是低劑量的診斷性輻射。結果提示，

TP53

的突變可能與輻射等環境因素導致的ATC易感性增加有關。

2.4 索拉非尼、拉帕提尼等藥物可作為攜帶TP53錯義突變ATC患者的候選靶向藥

利用在線軟件CARE分析

TP53

的錯義突變與藥物反應性的關系，

TP53

突變下出現耐藥性的藥物如表1所示，

TP53

突變下具有反應性的藥物如表2所示。

TP53

的突變導致大量藥物出現耐藥性，如Nutlin-3、GW2580、PLX4720、普納替尼(Ponatinib)、達拉菲尼(Dabrafenib)。在

TP53

發生錯義突變時，有部分藥物呈現高反應性，如CP-724714、拉帕提尼(Lapatinib)、魯索替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、尼洛替尼(Nilotinib)。在以上藥物中，索拉非尼已經在國內獲批用于治療局部復發或轉移的放射性碘難治性DTC。在針對ATC的臨床Ⅱ期試驗中，也發現索拉非尼具有良好的療效。這也進一步說明通過CARE軟件作出的預測結果具有可靠性。

表1 TP53突變下出現耐藥性的藥物

表2 TP53突變下具有反應性的藥物

3 討論

精準醫療是今后醫學發展的方向，其通過對疾病不同狀態和過程精確分類，最終實現對疾病和患者進行個性化精準治療。盡管靶向藥物如凡德他尼、索拉非尼、卡博替尼已經被批準用于治療甲狀腺癌，但是現在的甲狀腺癌的精準治療還遠遠達不到以精準診斷為基礎的個體化治療，而探索靶向藥物聯合應用與針對特定人群精準選擇靶向藥物是甲狀腺癌精準醫療的新趨勢。有研究報導CNV與甲狀腺癌的預后密切相關。因此，在本研究中利用cBioPortal數據庫對惡性程度最高的ATC進行了CNV與基因突變的聯合分析。篩選出

TP53

、

PI3KCA

與

ARID2

三個遺傳變異頻率最高的基因。在生存分析中，發現僅有

TP53

的錯義突變與患者生存率下降存在密切關系。因此，可推薦將

TP53

的錯義突變作為ATC的候選治療靶點，并且進行了進一步的分析。但是，以上結果不能完全排除其他基因與

TP53

的其他基因變異形式對患者生存率產生影響。原因有兩個，第一是某些基因變異形式如CNV的發生率較低，如

ARID2

僅有1個患者出現；第二是ATC惡性程度高，ATC患者的生存期普遍較短。進一步分析了

TP53

參與ATC發病的可能機制及

TP53

錯義突變導致的藥物耐藥，并篩選出若干可能有效的靶向藥物。MDM2是P53的相互作用蛋白，可以介導P53的降解，加速惡性轉化。Nutlin-3是MDM2的拮抗劑，可重新激活野生型

TP53

的轉錄活性，繼而誘導癌細胞凋亡。分析結果表明

TP53

的錯義突變能夠導致患者對以P53、MDM2為靶點的Nutlin-3的耐藥。除了普納替尼、達拉菲尼等藥物，還有大量藥物在篩選中被發現出現耐藥性，如AZD8055、delalisib、Masitinib等。拉帕提尼是一種雙重酪氨酸激酶抑制劑，可以阻斷ERBB2(也稱為HER2)和EGFR途徑，臨床上主要用于治療HER2陽性的晚期或轉移性乳腺癌。EGFR過度表達于ATC，EGFR抑制劑吉非替尼也被發現抑制ATC的生長。因此，我們推測拉帕提尼作為EGFR靶向藥具有應用于治療ATC的潛力。魯索替尼是JAK激酶抑制劑，臨床上用于治療骨髓纖維化；亦有實驗證實其可用于癌癥治療，如出現系統性炎癥的轉移性胰腺癌。JAK/STAT3信號通路的抑制能夠抑制ATC細胞及ATC裸鼠移植瘤的生長。因此，我們認為魯索替尼可以作為攜帶

TP53

錯義突變ATC患者的候選靶向藥物。總之，通過對ATC患者的基因組數據進行挖掘，我們發現

TP53

錯義突變是與ATC患者預后關系最密切的基因變異，而索拉非尼、拉帕提尼、魯索替尼等藥物可成為攜帶

TP53

錯義突變ATC患者的候選靶向藥。