鹿血清預處理對大鼠心肌細胞缺糖損傷的保護作用

趙 寧，杜健鵬，孫震曉

(1．中國中醫科學院西苑醫院藥劑科，北京100091；2．中國中醫科學院西苑醫院心血管科，北京 100091；3．北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488)

心肌缺血再灌注損傷是指在病理損傷過程中，心肌細胞在一段時間內出現缺血，血液恢復供應后，出現較灌注之前更嚴重的損傷，如出現心律失常、心肌梗死面積加大等。中醫根據其病變部位及胸悶、胸痛等臨床表現，將該病歸屬于“胸痹”“心悸”等范疇。

鹿血為鹿科動物梅花鹿

Cervus nippon

T.或者馬鹿

C.elaphus

L.的茸血或膛血，性熱，味甘咸，歸肝腎二經，是歷代本草均有記載的名貴中藥。最早見孫思邈的《千金·食治》，記載其“生血，治癰腫”?，F臨床應用及研究多為調節免疫、治療失眠及化療后骨髓抑制等，除此之外，鹿血還有治療心悸，對心臟功能有影響，但機制尚不明確。本研究擬在細胞水平，參照Zhang等的文獻報道，使用無糖DMEM培養基培養造成心肌細胞缺糖損傷，部分模擬缺血再灌注體外模型，探索鹿血預處理對心肌缺血損傷的保護作用及可能的作用機制，為鹿血用于臨床治療心悸提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

出生1～3 d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購于北京大學醫學部實驗動物科學部，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2016-0010，實驗動物使用許可證號SYXK(京)2016-0041。

1.2 試驗藥物及試劑

鹿全血(馬鹿)由內蒙古建元鹿業有限責任公司贊助；羊全血(綿羊)由北京大學醫學部實驗動物科學部提供。高糖DMEM培養基和Ⅳ型膠原酶購于Gibco公司；無糖DMEM培養基購于Invitrogen公司。胰蛋白酶購于北京拜爾迪生物技術有限公司。胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondial-dehyde，MDA)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

本試驗使用的主要儀器有：倒置顯微鏡TE2000-S(Nikon公司)，CO培養箱 MCO-18A/C(UV)(Sanyo公司)，酶標儀Spectra Max190(美國分子儀器公司)，VD-1320型潔凈工作臺(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)，高速臺式離心機(Sigma公司)，冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)。

1.4 受試品處理及濃度選擇

將鹿全血在室溫下3 000 r/min離心10 min，取上清為鹿血清，冷凍干燥至粉末狀；將凍干粉末用適量高純水以近飽和濃度溶解，過濾除菌后測定蛋白質濃度為30 mg/mL，分裝并凍存于-70°C冰箱中備用。實驗時分別用高糖DMEM培養基稀釋至5、10、20 mg/mL共3個不同濃度。羊全血的處理同上。

1.5 心肌細胞培養

將SD大鼠乳鼠酒精消毒，用滅菌的眼科直剪于第3、4肋骨處橫剪，心臟躍出，換新眼科直剪取心尖，將取出的心尖在不含鈣和鎂的HBSS中清洗2次，之后剪成1 mm的小塊，轉移到血清瓶中，加入3 mL含有0.05%胰酶和0.1%Ⅳ型膠原酶的酶液，于37℃水浴振蕩消化，3 min后將上清棄掉，繼續加消化液，于37℃水浴振蕩消化7 min，取上清與含有血清的培養基混勻終止消化，重復消化至組織塊消失。于室溫1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入高糖DMEM培養基(含有10%胎牛血清)，輕柔吹打混勻細胞接種于細胞瓶中，90 min差速貼壁后，將未貼壁的懸浮在上清液中的心肌細胞按5×10個/mL均勻接種在96孔板中，37℃、CO體積分數為5%的培養箱中培養，24 h后換液，并加入終濃度為1 μmol/L的阿糖胞苷以抑制非心肌細胞生長，隔天換液。

1.6 分組及心肌細胞缺糖損傷模型的建立

心肌細胞在96孔板中常規培養72 h后，將致密單層、生長狀態相同的細胞隨機分為正常對照組，模型組，鹿血清低、中、高劑量組(分別為5、10、20mg/mL)，羊血清低、中、高劑量組(分別為5、10、20 mg/mL)，共8組，每組至少平行6個孔。鹿血清組及羊血清組分別加入不同濃度受試物，預處理培養細胞6和12 h兩種情況后，參照Zhang等制定的缺糖損傷模型方法，除正常對照組外，均以無糖DMEM培養基培養心肌細胞18 h引發缺糖損傷，取出細胞板，各組換用高糖DMEM培養基(含有10%胎牛血清)，置于細胞培養箱中培養24 h進行復糖處理。然后進行細胞活力和相關指標的測定。

1.7 觀察指標及方法

1.7.1 細胞形態學觀察

缺糖損傷18 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態，并拍照記錄。

1.7.2 MTT法檢測細胞活力

設定空白對照孔，各組細胞用PBS洗滌后，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液200 μL，37℃孵育4 h，倒掉溶液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度

D

(490)值，根據下列公式計算細胞相對活力。

1.7.3 LDH、MDA及SOD、GSH-Px活性測定

按1.6中的實驗分組，選取加入受試物預處理12 h后，測定各組培養液中LDH、MDA濃度，以及SOD、GSH-Px的活性，操作均按各試劑盒的說明書進行。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 形態學觀察結果

2.1.1 心肌細胞培養形態學觀察

參照相關文獻，利用穩定的心肌細胞培養的實驗條件和方法，成功培養了純度高、存活時間長的新生SD大鼠的心肌細胞，可用于體外實驗研究。經觀察培養3～4 d的心肌細胞存活率在90%以上，達到實驗要求。

經差速貼壁法去除非心肌細胞后，分離得到的心肌細胞未貼壁時開始計時，在倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓形，折光性好，如圖1A。24 h后心肌細胞大部分貼壁生長，伸出偽足呈梭形、多角形，出現自發性搏動，如圖1B。3 d后心肌細胞逐漸形成細胞簇，可見同簇細胞同步搏動，最后心肌細胞連接成片生長，大面積同步搏動，如圖1C。

圖1 培養不同時間的心肌細胞形態觀察

2.1.2 無糖DMEM培養基培養的心肌細胞形態學觀察

利用無糖DMEM培養基培養心肌細胞18 h后的心肌細胞胞內顆粒明顯增多，胞體收縮成一團，搏動時快時慢，無節律，部分心肌細胞跳動不明顯，見圖2。

圖2 缺血損傷的心肌細胞和正常心肌細胞比較

2.2 鹿血清對心肌細胞缺糖損傷后活力的影響

圖3 不同濃度鹿血清預處理6 h對心肌細胞缺糖損傷后細胞活力的影響(n=3)

2.2.1 不同濃度鹿血清及羊血清預處理6 h對心肌細胞缺糖損傷后細胞活力的影響

MTT檢測結果見圖3，與正常對照組和模型組比較，不同濃度(5、10、20 mg/mL)鹿血清及羊血清組心肌細胞相對活力均增加(

P

＜0.01)；鹿血清與羊血清組間比較，差異無統計學意義(

P

＞0.05)。

2.2.2 不同濃度鹿血清及羊血清預處理12 h對心肌細胞缺糖損傷后細胞活力的影響

MTT檢測結果見圖4，不同濃度(5、10、20 mg/mL)鹿血清組心肌細胞相對活力較模型組增加(

P

＜0.01)，不同濃度(5、10、20mg/mL)羊血清組心肌細胞相對活力與模型組比較差異無統計學意義(

P

＞0.05)；與正常對照組比較，模型組，不同濃度鹿血清組、羊血清組心肌細胞相對活力均下降(

P

＜0.05或0.01)；鹿血清與羊血清組比較，20 mg/mL鹿血清組心肌細胞相對活力高于20 mg/mL羊血清組(

P

＜0.01)。

圖4 不同濃度鹿血清預處理12 h對心肌細胞缺糖損傷后細胞活力的影響(n=3)

2.3 鹿血清預處理對心肌細胞缺糖損傷的保護作用機制研究

2.3.1 細胞培養液中LDH濃度測定結果

見表1，與正常對照組比較，模型組心肌細胞培養液中LDH活性比正常組高(

P

＜0.01)，說明缺糖培養已經對心肌細胞造成損傷，破壞了細胞膜的完整性，導致細胞內LDH泄漏。與模型組比較，不同濃度鹿血清預處理組細胞培養液中的LDH濃度均較模型組低，差異有統計學意義(

P

＜0.01)。

表1 細胞培養液中LDH濃度的測定結果(n=3)

2.3.2 MDA濃度及GSH-PX、SOD活性的測定結果

見表2，與正常對照組相比，模型組心肌細胞培養液中MDA濃度升高(

P

＜0.05)，GSH-PX和SOD活性顯著降低(

P

＜0.01)。不同濃度鹿血清組和羊血清組MDA濃度與模型組比較差異無統計學意義(

P

＞0.05)；20 mg/mL鹿血清組，5、10、20 mg/mL羊血清組GSH-PX活力較模型組升高(

P

＜0.01)；10 mg/mL鹿血清組SOD活性較模型組升高(

P

＜0.01)。

表2GSH-PX、SOD活性及MDA濃度的測定結果(n=3)

3 討論

近年研究發現鹿血對離體蛙心有增強心肌收縮力的強心作用，其酒制品有提高雌性去勢大鼠的雌激素水平及抗氧化作用。為進一步探究鹿血對心功能的作用及機制，本研究從細胞水平及分子生物學角度出發，利用原代培養的心肌細胞作為穩定而有效的研究模型，進行造模實驗。對原代心肌細胞損傷造模的方法很多，常用的有利用過氧化氫、氯化鈷、異丙基腎上腺素等化學物質對心肌細胞造成氧化、化學性缺氧缺血等損傷，還有使用無糖培養基和無氧環境培養等方法對心肌細胞造成缺血缺氧損傷?；瘜W藥物對心肌細胞引起的損傷快速且較明顯，而鹿血作為傳統名貴中藥，在臨床使用過程中與其他西藥相比可能存在起效緩，作用時間長，預防作用強于治療作用的特點，綜合考慮以上原因，本實驗選擇了利用無糖培養基對心肌細胞進行缺糖損傷，部分模擬臨床心肌缺血的情況造模，研究鹿血清預處理對缺糖損傷的心肌細胞活力影響，從細胞水平揭示鹿血對心臟功能的作用。

心肌細胞損傷時會產生大量的自由基，其引發的氧化損傷是心肌細胞損傷的一個重要因素，是介導細胞結構損傷和功能代謝障礙的重要途徑之一。本研究結果顯示，無糖DMEM培養基可以導致心肌細胞相對活力顯著降低，凋亡發生率升高，細胞形態學、活動功能、細胞代謝改變。經鹿血清預處理后的心肌細胞在缺糖損傷后活力降低明顯減慢，提示鹿血清預處理可誘發顯著的心肌細胞預適應保護作用，并且在預處理時間較長(12 h)的情況下，鹿血清比羊血清對心肌細胞的保護作用更顯著。

胞漿酶自胞內漏出至培養液中常作為細胞損傷的標志，其中LDH是較為明顯和簡便的指標，本研究中心肌細胞缺糖培養18 h，結果發現模型組LDH量遠遠高于正常對照組。MDA是不飽和脂肪酸氧化的終產物，其水平的高低可反映機體脂質過氧化的程度。SOD、GSH-PX作為體內有效的自由基清除劑，它們的催化活性對維持氧化平衡系統非常重要。模型組MDA含量顯著升高，說明缺糖損傷造成了脂質氧化物的產生，同時GSH-PX和SOD活性顯著降低，說明無糖培養對心肌細胞造成了一定程度的氧化損傷。與模型組相比，鹿血清預處理組MDA含量降低，GSH-PX和SOD活性顯著升高，說明鹿血清具有提高心肌細胞內GSH-PX和SOD活性的能力，能起到保護細胞防止脂質過氧化和氧自由基損傷的作用。結果提示鹿血清對缺血心肌細胞的保護作用可能與其對抗氧自由基損傷及穩定細胞膜有關，但確切的機制還有待進一步研究。