槲皮素對異煙肼誘導肝細胞毒性的保護作用及其機制

陳廷玉，陳大印，沈 洪，富徐燕，盧春鳳，

(1．湖州師范學院醫學院，浙江 湖州 313000；2．佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

近年來，結核病發病率在全球又呈迅速回升趨勢，已成為世界性的公共衛生問題。在抗結核治療方案中異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)是不可替代的一線抗結核藥。臨床和實驗研究已證明INH可引起肝損傷，有時甚至發生急性肝衰竭，其明顯的肝毒性嚴重限制了它的臨床應用。雖然有關INH肝毒性作用及其機制已有研究，但對其認識目前仍不十分清楚，導致臨床在防治INH肝毒性時存在明顯盲目性，甚至出現了濫用保肝療法的情況。因此，闡明INH肝毒性機制，尋找合適的肝保護劑已成為抗結核治療亟需解決的問題。

槲皮素作為一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化及清除自由基、調節免疫功能及抗腫瘤、抗肝纖維化、抗菌、抗血小板聚集等多種藥理作用，且易于提取，使用安全，具有理想的臨床應用前景。課題組前期研究發現INH可誘導肝細胞凋亡及氧化損傷，并且槲皮素對其具有保護效應，但其具體作用機制尚未闡明。因此，本研究以L-02正常人肝細胞為實驗對象，建立INH誘導的肝細胞損傷模型，以線粒體為靶點，以活性氧(reactive oxygen species，ROS)為切入點，通過應用ROS清除劑谷胱甘肽(glutathion，GSH)后，比較槲皮素處理細胞前后INH對ROS介導的氧化應激的影響，探討ROS介導線粒體氧化損傷在INH肝細胞毒性中的作用及槲皮素對INH肝細胞毒性的保護效應，為尋找有效防治INH肝毒性藥物及進一步研究槲皮素的臨床應用提供實驗基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

L-02細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所；DMEM培養基為Gibco公司產品；FBS為Hyclone公司產品；異煙肼、槲皮素、GSH(ROS清除劑)、DCFHDA、Rh-123等為Sigma公司產品；8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanine nucleoside，8-OHdG)ELISA試劑盒、蛋白質羰基含量測定試劑盒為Abcam公司產品；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理

L-02細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液常規培養，將細胞隨機分為：異煙肼組，給予10 mmol/L INH；槲皮素處理組，給予10mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素；谷胱甘肽預處理組，先用ROS清除劑GSH 20 mg/mL預處理細胞1 h，然后給予10 mmol/L INH和50 μmol/L槲皮素；谷胱甘肽組，用ROS清除劑GSH 20 mg/mL處理細胞1 h；對照組，給予等體積的無血清培養基。將生長良好的指數生長期細胞，按上述分組進行處理，培養24 h，收集細胞進行相關指標檢測。

1.2.2 熒光探針DCFH-DA檢測細胞線粒體ROS水平

細胞按上述實驗分組進行處理，收集各組細胞，采用差速離心法制備細胞線粒體。將上述各組細胞線粒體用HEPES緩沖液重懸，并吹打均勻制成線粒體懸液，加入熒光探針DCFH-DA 10 μmol/L，37℃孵育30 min，使用多功能酶標儀，在激發波長490 nm下，測定其熒光強度

D

(490)。ROS水平以相對值表示，即

D

(490)/

D

(490)×100%。

1.2.3 熒光探針Rho-123檢測細胞線粒體膜電位

將上述線粒體懸液，加入Rho-123染色液，使其終濃度為5 mg/L，置于培養箱內避光孵育20 min，冷PBS漂洗去除非特異性熒光后，使用多功能酶標儀測定其熒光強度(激發波長490 nm)。線粒體膜電位以相對值表示，即

D(

490)/

D(

490)×100%。

1.2.4 氧化損傷指標檢測

細胞按上述分組處理后，采用TBA比色法測定脂質過氧化產物MDA含量；應用DPNH比色法測定蛋白氧化損傷產物蛋白質羰基的含量；采用ELISA法檢測mtDNA氧化損傷的產物8-OHdG含量，評價細胞線粒體氧化損傷狀態。應用BCA法測定細胞樣品蛋白含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 槲皮素和GSH處理后L-02細胞線粒體ROS相對水平

熒光探針DCFH-DA檢測結果見圖1。與對照組相比，INH處理細胞后細胞線粒體ROS相對水平升高(

P

＜0.01)，表明INH可誘導線粒體ROS的生成。與異煙肼組相比，槲皮素處理組細胞線粒體ROS相對水平降低(

P

＜0.01)，表明槲皮素可抑制細胞線粒體ROS的生成；谷胱甘肽預處理組細胞線粒體ROS相對水平低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明ROS清除劑GSH能明顯抑制INH對線粒體ROS生成的促進作用。

圖1 L-02細胞線粒體ROS相對水平

2.2 槲皮素和GSH處理后L-02細胞線粒體膜電位相對水平

熒光探針Rho-123檢測結果見圖2，與對照組相比，細胞經INH處理后線粒體膜電位降低(

P

＜0.01)，表明INH可造成線粒體損傷。槲皮素處理組細胞線粒體膜電位高于異煙肼組(

P

＜0.05)，表明槲皮素對INH誘導的細胞線粒體損傷有保護作用；谷胱甘肽預處理組細胞線粒體膜電位高于槲皮素處理組(

P

＜0.05)。此結果提示ROS參與INH引起的細胞線粒體損傷。

圖2 L-02細胞線粒體膜電位相對水平

2.3 槲皮素和GSH處理后L-02細胞中的MDA含量

TBA比色法檢測結果見圖3，與對照組相比，細胞經INH處理后MDA含量增加(

P

＜0.01)，表明INH可誘導脂質過氧化反應。與異煙肼組比較，應用槲皮素后可使MDA含量減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素可以抑制INH誘導的脂質過氧化反應；谷胱甘肽預處理組MDA含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導的脂質過氧化反應。此結果提示，ROS參與了INH引起的肝細胞線粒體脂質過氧化反應。

圖3L-02細胞MDA含量

2.4 槲皮素和GSH處理后L-02細胞中的蛋白質羰基含量

DPNH比色法檢測結果見圖4，與對照組比較，INH處理細胞后，可增加細胞蛋白羰基含量(

P

＜0.01)，表明INH可造成蛋白氧化損傷。與異煙肼組比較，槲皮素可使蛋白羰基含量減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素對INH誘導的蛋白氧化損傷有保護作用；谷胱甘肽預處理組蛋白羰基含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導的蛋白氧化損傷。此結果提示，ROS參與INH引起的蛋白氧化損傷。

2.5 槲皮素和GSH處理后L-02細胞中的8-OHdG含量

ELISA檢測結果見圖5，與對照組比較，INH處理細胞后8-OHdG含量增加(

P

＜0.01)，表明INH可造成mtDNA氧化損傷。應用槲皮素可使8-OHdG含量低于異煙肼組(

P

＜0.01)，表明槲皮素對INH誘導的mtDNA氧化損傷具有保護作用；谷胱甘肽預處理組8-OHdG含量低于槲皮素處理組(

P

＜0.05)，表明給予ROS清除劑GSH能明顯地抑制INH誘導的mtDNA氧化損傷。此結果提示，ROS參與INH引起的mtDNA氧化損傷。

圖4 L-02細胞蛋白質羰基含量

圖5 L-02細胞8-OHdG含量

3 討論

INH對肝臟的損傷機制是多重和復雜的，確切機制至今仍不是很清楚，但普遍認為，INH的肝毒性是由其代謝產物介導的。Ergul等研究發現，INH可引起肝臟氧化損傷，而抗氧化劑能夠對抗INH引起的肝損傷。課題組前期研究應用大鼠從整體動物水平觀察了INH對大鼠肝臟的影響，結果發現INH可造成大鼠肝臟氧化損傷。這些研究表明，氧化損傷在INH肝毒性中具有重要作用。INH在體內代謝過程中通過氧化還原反應產生ROS，過量ROS有可能是INH產生肝毒性的主要因素。研究表明，ROS過多生成可損傷線粒體膜，導致線粒體膜電位降低。因此，本實驗檢測了L-02細胞線粒體ROS水平及線粒體膜電位。結果顯示，L-02細胞經INH處理后，線粒體ROS水平升高，膜電位降低，表明INH可促進線粒體ROS生成，造成線粒體損傷。那么INH導致的肝細胞損傷是否與ROS介導的線粒體氧化損傷有關？本研究進一步檢測了細胞線粒體氧化損傷的重要指標：脂質過氧化產物MDA、蛋白質氧化產物蛋白羰基、mtDNA氧化損傷產物8-OHdG，其含量的多少可反映細胞線粒體氧化損傷的程度。本實驗研究發現，L-02細胞經INH處理后，MDA、蛋白質羰基及8-OHdG含量增加，表明在本實驗條件下，INH可促進線粒體ROS產生，導致線粒體氧化損傷。這與Bansal等的研究結果一致。

研究表明，槲皮素在體外可通過清除氧自由基、抑制DNA損傷等發揮抗氧化作用，有希望成為抗超氧陰離子的新藥。本實驗結果顯示，槲皮素能明顯減少L-02細胞線粒體ROS生成，并增加線粒體膜電位，表明槲皮素可抑制ROS生成，改善線粒體功能。結果還發現，應用槲皮素后可使MDA、蛋白羰基、8-OHdG含量減少，表明槲皮素對INH誘導的細胞線粒體氧化損傷具有保護效應，其機制可能與槲皮素減少細胞線粒體ROS生成，抑制細胞線粒體氧化損傷有關。Zou等研究發現槲皮素具有逆轉HO引起的細胞氧化損傷和凋亡作用，其機制與抗氧化和穩定線粒體膜，阻止促凋亡途徑有關，提示槲皮素對線粒體氧化損傷有保護作用。在其他實驗模型研究中也發現，槲皮素也可以通過抑制細胞線粒體膜通透性轉換孔開放和ROS生成，減輕肝細胞線粒體氧化損傷。因此，我們認為槲皮素清除細胞線粒體ROS，抑制線粒體氧化損傷可能是其抗INH肝毒性的主要機制之一。

為了明確ROS在INH誘導肝細胞線粒體損傷中的作用，并探討ROS介導的線粒體氧化損傷在槲皮素抗INH肝細胞毒性中的作用，本研究通過應用ROS清除劑GSH清除肝細胞內ROS，分析槲皮素處理細胞前后INH對ROS介導的線粒體氧化應激的影響，以評價ROS介導的線粒體氧化損傷在INH肝細胞毒性及槲皮素抗INH肝細胞毒性中的作用。本研究結果顯示，當加入ROS清除劑后，細胞線粒體ROS水平、MDA、蛋白羰基、8-OHdG的含量進一步降低，而線粒體膜電位升高。表明在INH處理細胞前給予ROS清除劑GSH能明顯抑制INH誘導的細胞線粒體氧化損傷，提示ROS參與了INH導致的肝細胞線粒體氧化損傷，證實了ROS介導的線粒體損傷在INH誘導肝細胞毒性中發揮了重要的作用。本研究還發現，應用ROS清除劑后，槲皮素對INH誘導的線粒體氧化損傷的抑制作用更明顯，進一步證實ROS介導的氧化損傷在槲皮素抗INH肝細胞毒性中發揮重要的作用。本研究結果還提示，槲皮素對INH肝細胞毒性的保護效應除了與其能清除ROS有關外，可能還有其他的機制參與。

總之，在本實驗條件下，INH可誘導L-02肝細胞線粒體發生氧化損傷，ROS介導的線粒體氧化損傷在INH誘導肝細胞毒性中發揮了重要作用；槲皮素對INH誘導的線粒體氧化損傷具有保護效應，其機制可能與清除線粒體ROS，抑制ROS介導的線粒體氧化損傷有關。但具體機制尚有待進一步深入研究。