‘鄂馬鈴薯3號’對干旱脅迫早期響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析

劉圣宣，程云霞，劉騰飛*，宋波濤

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室/湖北馬鈴暮工程技術(shù)研究中心/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070；2.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是繼水稻、玉米和小麥之后，全球第四大糧食作物，為保障全球糧食安全以及滿足未來人口增長對糧食的進(jìn)一步需求等方面起著重要作用。馬鈴薯也是中國第四大農(nóng)作物，因其具有高產(chǎn)、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高及產(chǎn)業(yè)鏈長等優(yōu)點，從而成為貧困地區(qū)的主要糧食作物。此外，在不擠占糧食作物用地的前提下，通過種植馬鈴薯能有效擴(kuò)充糧食供給，保障國家糧食安全。中國馬鈴薯年種植面積及總產(chǎn)量均居世界首位，種植面積和產(chǎn)量分別占全球的27.38%和24.53%[1]，但是就馬鈴薯平均單產(chǎn)而言，中國是偏低的，甚至不及世界平均水平。由此可見，中國馬鈴薯的單產(chǎn)水平仍有很大的提升空間，而提高馬鈴薯單產(chǎn)水平的策略之一是選育優(yōu)良品種。

干旱脅迫是制約作物產(chǎn)量的重要因素之一，不僅造成作物減產(chǎn)，甚至導(dǎo)致作物絕收。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，由干旱引起的糧食減產(chǎn)率平均高達(dá)10.1%，是威脅糧食生產(chǎn)的最嚴(yán)重極端氣候災(zāi)害[2]。作為干旱敏感作物，馬鈴薯的生長發(fā)育和產(chǎn)量的形成均受到干旱的嚴(yán)重威脅，其種植面積的擴(kuò)大也受到干旱因素的限制[3]。因而，選育具有干旱抗性的新品種對于馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著積極意義。

由于固著生長的屬性，植物在整個生命周期中需要應(yīng)對各種不同脅迫的挑戰(zhàn)，因而進(jìn)化出了強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力。植物細(xì)胞通過改變細(xì)胞膨壓或是膜受體活性來識別環(huán)境脅迫。隨后胞外信號通過第二信使傳遞轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，啟動逆境下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而積累脅迫相關(guān)的蛋白和代謝物應(yīng)對逆境[4]。植物響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要由脫落酸（Abscisic acid，ABA）依賴和非ABA 依賴兩種途徑實現(xiàn)。其中ABA 響應(yīng)元件（ABA-responsive element，ABRE）和轉(zhuǎn)錄因子ABRE-binding protein/ABRE-binding factors（AREB/ABFs）在 ABA 依賴途徑的基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，與之類似干旱響應(yīng)元件（Dehydration-responsive element/C-repeat， DRE/CRT）和轉(zhuǎn)錄因子Dehydration responsive element binding（DREB）factors 在非ABA 依賴途徑的基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用[4]。

由于馬鈴薯根系淺并且稀疏的特征，大多數(shù)栽培種對干旱脅迫較為敏感，水分缺乏能抑制甚至完全停止馬鈴薯許多生理過程，如光合作用、呼吸作用和胞內(nèi)的酶促反應(yīng)[5]，甚至短時間的干旱脅迫都能嚴(yán)重危害馬鈴薯的正常生長發(fā)育，最終影響塊莖產(chǎn)量和品質(zhì)[6]。由于同源四倍體栽培種馬鈴薯遺傳背景復(fù)雜的特征，相較于其他作物，對馬鈴薯抗旱性研究機(jī)制嚴(yán)重滯后。近些年，利用RNA-seq 或Microarray 技術(shù)，多項研究對馬鈴薯干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了分析[7-14]，結(jié)果顯示多種信號通路和代謝通路參與了馬鈴薯對干旱脅迫的響應(yīng)，如ABA 途徑、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除、胚胎發(fā)育晚期富集蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）和熱激蛋白的累積，碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑。然而，研究極少針對馬鈴薯干旱脅迫早期的響應(yīng)特征進(jìn)行探究。基于此本研究利用栽培品種‘鄂馬鈴薯3 號’組培苗通過短時間干旱脅迫處理，通過形態(tài)觀察，含水率變化測定及轉(zhuǎn)錄組分析以揭示馬鈴薯應(yīng)對干旱脅迫的早期響應(yīng)特征，為馬鈴薯抗旱性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用的馬鈴薯材料為栽培品種‘鄂馬鈴薯3 號’（Solanum tuberosum cv. E3）。馬鈴薯試管苗培養(yǎng)于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬鈴薯生物學(xué)及生物技術(shù)重點實驗室的培養(yǎng)室，培養(yǎng)室溫度設(shè)定為20℃，光照設(shè)定為（16 h 光照/8 h 黑暗），光照強(qiáng)度為400～600 μmol/m2·s。

1.2 材料處理

將‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗在4%蔗糖的MS 培養(yǎng)基生長2 周后用于試管苗的干旱處理，處理方法為將試管苗整株拔出，放在吸水紙上置于環(huán)境控制良好的培養(yǎng)室中（溫度為20℃，濕度為50%）進(jìn)行模擬干旱早期脅迫處理。分別在處理0，1 和6 h 進(jìn)行整株取樣，每5 株作為一個重復(fù)，每個時間點取3 次重復(fù)進(jìn)行后續(xù)表型及含水量分析和RNA 抽提。

1.3 含水量測定

取樣后立即對每個樣本進(jìn)行稱重，質(zhì)量記為M1。然后將樣品放入恒溫干燥箱，烘干至恒重后，質(zhì)量記為M2。含水量（%）=（M1 - M2）/M1 ×100，而后將結(jié)果導(dǎo)入GraphPad Prism 9 統(tǒng)計軟件進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism 9 內(nèi)置的One-way ANOVA 多重比較方法。

1.4 RNA抽提、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組分析

將上述樣品在液氮中研磨成粉末，利用植物總RNA 提取試劑盒（RN33，艾德萊，中國）進(jìn)行抽提，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。每個樣品取約2 μg RNA 用于文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建及測序委托北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。獲得的clean data 利用Salmon v.1.4.0 以DM1-3 v6.1（http://spuddb.uga.edu/dm_v6_1_download.shtml）轉(zhuǎn)錄本注釋作為參考，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行量化[15,16]。隨后將Salmon 輸出的數(shù)據(jù)導(dǎo)入R 包DESeq2[17]，進(jìn)一步進(jìn)行差異表達(dá)分析。差異基因篩選的閾值為FDR ＜0.01, log2（fold change）＞1。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中的表型及含水量變化

分別對‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗不同干旱處理時間后的表型進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1A 所示。干旱處理0 h 時，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗表現(xiàn)正常，在干旱處理1 h 后出現(xiàn)了微弱的萎蔫現(xiàn)象，而當(dāng)干旱處理6 h 后‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗葉片出現(xiàn)了明顯的萎蔫，說明此時馬鈴薯已經(jīng)出現(xiàn)了干旱脅迫。隨后進(jìn)一步對不同處理時間馬鈴薯葉片的含水量進(jìn)行了測定，測定結(jié)果如圖1B 所示。與表型觀察結(jié)果相一致，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗在干旱處理0 h 時含水量最高，在處理1 h 后顯著降低，而處理6 h 后含水量進(jìn)一步降低。上述結(jié)果表明，隨著干旱處理時間的延長，‘鄂馬鈴薯3號’試管苗受脅迫的程度逐步加深。

圖1 馬鈴薯干旱脅迫處理不同時間點的表型及含水量分析Figure 1 Phenotype and water content analysis of potato at different time points under drought stress

2.2 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中轉(zhuǎn)錄組分析

為了揭示‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中的轉(zhuǎn)錄變化，分別取上述干旱處理時間點的試管苗進(jìn)行RNA 抽提和轉(zhuǎn)錄組測序分析。每個時間點取3 個重復(fù)，3 個時間點總共構(gòu)建并測序了9 個轉(zhuǎn)錄組文庫。測序獲得的原始reads 比對到最新注釋的DM1-3 轉(zhuǎn)錄本上，并將比對到多個轉(zhuǎn)錄本的reads 進(jìn)行了剔除。主成分分析（Principal component analysis，PCA）顯示，‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中各個時間點上的重復(fù)性較好，并且不同時間點間出現(xiàn)明顯分離（圖2），說明不同時間點間樣品的整體轉(zhuǎn)錄差異較大。

圖2 不同干旱處理時間點的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)主成分分析（PCA）Figure 2 Principal component analysis (PAC) for RNA-seq data at different time points under drought stress

2.3 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的基因差異表達(dá)分析

為了鑒定‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），分別對這3 個時間點進(jìn)行了兩兩比較，差異基因的閾值設(shè)置為FDR ＜0.01，差異表達(dá)倍數(shù)超過2，結(jié)果如圖3所示。1 h vs 0 h、6 h vs 0 h 及 6 h vs 1 h 分別鑒定到 5 315、9 728 和8 606 個差異表達(dá)基因，說明隨著處理時間的延長，差異基因的數(shù)量也進(jìn)一步增加。其中1 h vs 0 h 和 6 h vs 0 h 共同差異基因為 3 424 個，而所有不同處理間的共有差異基因為1 576 個。

圖3 維恩圖分析不同干旱處理時間點間的差異基因集Figure 3 Venn diagram analysis of DEG sets among different comparison groups

2.4 ‘鄂馬鈴薯3 號’試管苗干旱處理過程中不同時間點的top差異基因熱圖及注釋分析

為了揭示每個干旱處理時間點表達(dá)差異最大的部分基因，分別在1 h vs 0 h、6 h vs 0 h 及6 h vs 1 h 的差異基因中各選取了10 個上調(diào)和下調(diào)最為劇烈的基因。去除冗余后一共獲得了52 個差異基因，熱圖聚類及注釋如圖4 所示。這些基因明顯的可以聚為三大類，其中第一類是在處理0 h 時高表達(dá)，第二類則為處理6 h 時高表達(dá)，第三類為處理1 h 時高表達(dá)。其中Soltu.DM.03G035590.1和Soltu.DM.01G031660.1 分別編碼兩個轉(zhuǎn)錄因子GATA transcription factor 和Plant-specific transcription factor YABBY family protein，他們的表達(dá)量在干旱處理6 h 后極顯著降低，暗示其可能為馬鈴薯干旱調(diào)控的負(fù)向因子。在6 h 特異高表達(dá)的基因中，包含3 個LEA，而LEA 蛋白被認(rèn)為是一類干旱脅迫誘導(dǎo)蛋白。此外一個MYB 類的轉(zhuǎn)錄因子也在干旱處理6 h 特異高表達(dá)，暗示其可能是一個干旱特異誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可能正向調(diào)控馬鈴薯的抗旱性。

圖4 熱圖分析不同比較組中的上調(diào)和下調(diào)差異基因TOP10Figure 4 TOP10 up-regulated and down-regulated DEGs as illustrated in heatmap among different comparison groups

2.5 ABA信號途徑的相關(guān)組分在干旱誘導(dǎo)過程中的表達(dá)模式分析

ABA 信號途徑被認(rèn)為是在干旱脅迫過程中起重要作用，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，分別對已知的參與ABA 途徑重要的激酶SnRK2s 家族成員及其下游AREB/ABF/ABI5 類轉(zhuǎn)錄因子在馬鈴薯干旱處理過程中的差異變化進(jìn)行了探究，結(jié)果如表 1 所 示 。 8 個 StSnRK2s 和 7 個 AREB/ABF/ABI5s在1 h vs 0 h 組合中，6 個出現(xiàn)了2 倍以上的表達(dá)差異，其中上下調(diào)最為劇烈的分別是StSnRK2.1和StABL2。在6 h vs 0 h 組合中，除StSnRK2.2、StSnRK2.5、StABL1 和StABL2，其他基因均出現(xiàn)了兩倍以上的上調(diào)表達(dá)，說明這些ABA 信號途徑的相關(guān)基因均能受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。7 個AREB/ABF/ABI5s 轉(zhuǎn)錄因子成員中，StAREB1、StAREB2 和StAREB4 的表達(dá)量明顯高于其他4個，以StAREB2 的表達(dá)量最高，并且在干旱處理過程中的上調(diào)最為劇烈，暗示StAREB2 可能是參與干旱脅迫過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子。而StSnRK2.4 和StSnRK2.8 則為馬鈴薯干旱脅迫過程中高表達(dá)的激酶，且其表達(dá)在干旱處理6 h 后均出現(xiàn)超過兩倍的上調(diào)表達(dá)，表明StSnRK2.4 和StSnRK2.8 可能是響應(yīng)干旱脅迫過程中的重要蛋白激酶。

表1 馬鈴薯ABA信號途徑部分基因在不同比較組的表達(dá)差異分析Table 1 Differential expression analysis of potato ABA signal pathway-related genes among different comparison groups

3 討 論

馬鈴薯通常被認(rèn)為是干旱敏感性作物，由全球氣候變化引起的干旱頻發(fā)嚴(yán)重威脅了馬鈴薯的可持續(xù)生產(chǎn)。許多研究通過探究馬鈴薯耐旱性的生理、生化和遺傳基礎(chǔ)，試圖保證馬鈴薯在干旱脅迫下的產(chǎn)量。馬鈴薯對干旱的復(fù)雜表型反應(yīng)受其基因型、發(fā)育階段和環(huán)境的相互作用影響。因此利用生長條件受到嚴(yán)格控制的組培苗作為材料可以消除一定的干擾。破譯馬鈴薯的干旱應(yīng)答機(jī)制，解析馬鈴薯干旱應(yīng)答的核心因子，通過現(xiàn)代基因編輯等手段對這些核心因子進(jìn)行編輯，實現(xiàn)馬鈴薯抗旱性的增強(qiáng)對于破解因干旱導(dǎo)致的馬鈴薯種植限制有著巨大的潛在意義。基于此，本研究以普通馬鈴薯栽培種為材料，對馬鈴薯應(yīng)對干旱的早期響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探究。本研究發(fā)現(xiàn)利用組培苗為材料可以使得馬鈴薯在6 h 時即出現(xiàn)明顯的干旱脅迫表型（圖1），為研究馬鈴薯的干旱脅迫早期響應(yīng)提供了參考。

此外本研究還利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序?qū)︸R鈴薯干旱脅迫早期不同時間進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析。與前人研究結(jié)果類似，馬鈴薯在應(yīng)對干旱脅迫時能通過大量的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以適應(yīng)環(huán)境，本研究發(fā)現(xiàn)在干旱處理1 及6 h 時，出現(xiàn)兩倍差異的基因分別高達(dá)5 315 和 9 728 個（圖 3）。進(jìn)一步對 TOP10 差異上調(diào)和下調(diào)基因分析發(fā)現(xiàn)，兩個轉(zhuǎn)錄因子GATA transcription factor 和Plant-specific transcription factor YABBY family protein 的表達(dá)受到干旱的顯著抑制（圖4），可作為后續(xù)目標(biāo)進(jìn)行功能驗證。此外與前人結(jié)果類似，鑒定到3 個受干旱誘導(dǎo)的LEA 蛋白[18,19]，其在干旱處理6 h 后高豐度累積，可能是潛在的干旱誘導(dǎo)Marker 基因。MYB 類的轉(zhuǎn)錄因子在馬鈴薯干旱脅迫過程中起重要作用，過表達(dá)MYB 轉(zhuǎn)錄因子StMYB1R-1 能增強(qiáng)馬鈴薯抗旱性[20]。本研究同樣鑒定到一個MYB domain 蛋白在干旱處理6 h 特異高表達(dá)，后續(xù)研究也可以通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化探究其在馬鈴薯干旱脅迫中的功能。

ABA 在調(diào)控植物非生物脅迫方面起著重要作用，Liu 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ABA 能調(diào)控馬鈴薯在應(yīng)對土壤逐步干旱過程中的氣孔和光合水分利用效率。Gong 等[8]和 Chen 等[19]通過對馬鈴薯應(yīng)對干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果均表明干旱脅迫會誘導(dǎo)ABA 信號通路上相關(guān)基因的表達(dá)。Bai 等[22]在全基因組水平對馬鈴薯SnRK2s 進(jìn)行了鑒定和表達(dá)模式分析，結(jié)果顯示馬鈴薯基因組中存在8 個SnRK2s 成員，部分成員可能參與馬鈴薯對脅迫的響應(yīng)。全基因組范圍內(nèi)的序列鑒定和分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯基因組中有7 個AREB/ABF/ABI5 亞家族成員，其中部分成員能同時響應(yīng)ABA 和非生物脅迫處理[23]。在此研究中重點探究了這些StSnRK2s 和StAREB/ABF/ABI5s 的表達(dá)差異，再次驗證蛋白激酶 StSnRK2.4 和 StSnRK2.8 以 及 轉(zhuǎn) 錄 因 子StAREB2 可能是ABA 信號通路上響應(yīng)干旱脅迫過程中的重要組分（表1）。對于這些基因的進(jìn)一步深入研究將有利于揭示ABA 信號途徑在馬鈴薯干旱脅迫中的重要功能。后續(xù)研究通過深入挖掘上述可能的馬鈴薯應(yīng)答干旱脅迫的重要基因，解析其作用機(jī)制，將有利于加速抗旱種質(zhì)資源的篩選和抗旱品種的選育進(jìn)程，對于科學(xué)推進(jìn)中國馬鈴薯主糧化和主食化產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略具有極其重要的現(xiàn)實意義。