直腸癌新輔助放化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)性分子標(biāo)志物研究進(jìn)展

黃棟 杜金林

根據(jù)2014年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析統(tǒng)計(jì)，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率（27.08%）位于第三，死亡率（13.13%）位于第五［1］。直腸癌發(fā)病率約占結(jié)直腸癌總發(fā)病率的1/2，且以中低位直腸癌為主，中晚期直腸癌居多［2］。目前局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是新輔助放化療后的根治性手術(shù)。

雖然新輔助放化療可以提高中低位直腸癌的可切除性，但不同患者新輔助放化療治療的結(jié)果從完全緩解到無(wú)腫瘤退行不等，因此，在新輔助放化療前確定那些對(duì)新輔助放化療治療不敏感的患者至關(guān)重要，而在新輔助治療之前確定預(yù)測(cè)性的分子生物標(biāo)志物，對(duì)那些對(duì)新輔助放化療治療不敏感的患者極為重要。

生物標(biāo)志物的定義是“作為正常生物過(guò)程、致病過(guò)程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指標(biāo)而被客觀測(cè)量和評(píng)估的特征”。理想的生物標(biāo)志物應(yīng)具有足夠的敏感性、特異性，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。關(guān)于新輔助放化療療效的評(píng)估，文獻(xiàn)中多以TRG分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，在臨床實(shí)踐中最常見的四種 TRG 分級(jí)系統(tǒng)是由 Mandard 等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］（表1）提出的。在這篇綜述中，我們總結(jié)了近年來(lái)基于組織和血液的分子生物標(biāo)志物研究在預(yù)測(cè)直腸癌新輔助放化療反應(yīng)方面的進(jìn)展。包括研究生物標(biāo)志物與新輔助放化療反應(yīng)以及長(zhǎng)期預(yù)后（如OS和DFS）之間的關(guān)聯(lián)。

表1 最常用的腫瘤退化分級(jí)（tumor regression grade，TRG）系統(tǒng)

一、血液中的生物標(biāo)記物

1.蛋白質(zhì)和代謝物

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是CRC中被廣泛認(rèn)可的預(yù)后和疾病監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，CEA與新輔助放化療療效的關(guān)系已被深入研究。雖然一半以上的研究使用5 ng/mL作為CEA的截?cái)嘀担形从蠧EA升高的有效截?cái)嘀稻哂凶銐虻拿舾行院吞禺愋浴Ｓ醒芯繉⑿螺o助放化療前血清CEA濃度≤5.33 ng/mL作為預(yù)測(cè)直腸癌新輔助放化療敏感的指標(biāo)［7］。Song等［8］研究了674例接受新輔助放化療治療的局部進(jìn)展期直腸癌患者的資料，發(fā)現(xiàn)新輔助放化療后CEA水平、新輔助放化療前后CEA比值與腫瘤降期顯著相關(guān)。Dudani等［9］的研究發(fā)現(xiàn)新輔助放化療前CEA升高是無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS），短期總生存期（overall survival，OS）和病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶復(fù)合物的催化蛋白，利用端粒酶內(nèi)部RNA模板（TR）合成新端粒序列，延長(zhǎng)真核染色體末端的端粒，從而防止細(xì)胞衰老和死亡。Rampazzo等［10］的研究表明TERT水平的低表達(dá)以及新輔助放化療前后的TERT水平差異與新輔助放化療治療反應(yīng)相關(guān)。

2.循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTCs）

CTCs是一種實(shí)時(shí)的生物標(biāo)志物，在預(yù)測(cè)及篩選對(duì)新輔助放化療治療敏感或抵抗的患者方面表現(xiàn)出良好的前景［11］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)新輔助放化療敏感者在新輔助放化療后采集的血樣中的CTCs相對(duì)于不敏感者顯著下降［11-13］。

3.宿主免疫反應(yīng)

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、胃癌和食管癌等實(shí)體腫瘤中，局部和全身炎癥反應(yīng)與不良預(yù)后相關(guān)。這種與腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)可以通過(guò)血液學(xué)參數(shù)反映出來(lái)。其中，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比值（NLR）升高的被證明是pCR較差的預(yù)測(cè)因子［14-15］。也有多項(xiàng)研究表明新輔助放化療前的高水平白細(xì)胞計(jì)數(shù)與較差的治療反應(yīng)相關(guān)。Xiao等［16］則發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和淋巴細(xì)胞比率（lymphocyte ratio，LYMR）是pCR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

4.血管內(nèi)生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF在腫瘤放療的微環(huán)境中有重要作用。Yu等［17］測(cè)定了31例局部進(jìn)展中至低位直腸癌患者在接受新輔助放化療前的腫瘤標(biāo)本的5個(gè)生物標(biāo)志物（VEGF，PD-L1，DAXX，p-STAT3，EGFR）與新輔助放化療敏感性的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)只有VEGF表現(xiàn)為顯著的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

5.血小板計(jì)數(shù)

在臨床觀察中，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)不同類型的腫瘤中，血小板增高常與不良預(yù)后相關(guān)。Belluco等［18］將血小板計(jì)數(shù)300×109/L作為截?cái)嘀颠M(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在接受新輔助放化療治療的直腸癌患者中，治療前高的血小板計(jì)數(shù)是一個(gè)消極的預(yù)后因素。但是目前仍然很難定義一個(gè)最佳的血小板計(jì)數(shù)截?cái)嘀怠?/p>

6.循環(huán)腫瘤基因（ctDNA）

循環(huán)腫瘤基因是腫瘤細(xì)胞體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)記，是一種可以準(zhǔn)確反映腫瘤負(fù)荷的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Zhou等［19］發(fā)現(xiàn)ctDNA突變的中位變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）是無(wú)轉(zhuǎn)移生存期的強(qiáng)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

7.FOX轉(zhuǎn)錄因子家族

FOX蛋白是一類從酵母到人類都廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子。FOX家族蛋白功能涉及胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類、脂類代謝、生物老化及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程，其突變和表達(dá)異常與發(fā)育畸形代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)［20］。Zhang等［21］通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)FOXK1和FOXK2的過(guò)表達(dá)與新輔助放化療后較差的預(yù)后相關(guān)。

二、腫瘤組織中的分子生物標(biāo)記物

1.DNA突變和DNA甲基化

目前有許多研究人員將基因型生物標(biāo)志物作為新輔助放化療pCR的潛在預(yù)測(cè)因子。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)新輔助放化療反應(yīng)差的直腸癌相對(duì)與有良好反應(yīng)的直腸癌更容易同時(shí)發(fā)生KRAS和TP53突變（KP基因型）［22］。Wan等［23］發(fā)現(xiàn)8號(hào)染色體≥5個(gè)拷貝和CTCs中ARID1A，HDAC1，APC，ERBB3，TP53，AMER1，AR的8個(gè)非同義突變與pCR相關(guān)。

DNA甲基化被認(rèn)為是參與調(diào)控基因表達(dá)的重要表觀遺傳機(jī)制，并且基于DNA甲基化的生物標(biāo)記物被認(rèn)為是用于癌癥診斷和預(yù)后的有用工具。Canto等［24］對(duì)直腸癌和正常組織樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)完全病理緩解患者腫瘤中高甲基化探針相對(duì)于不完全病理緩解的患者比例較高。

2.MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一種高度保守的小的非編碼RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，參與基因的表達(dá)后調(diào)控。Machackova等［25］發(fā)現(xiàn)miR-487a-3p與不完全緩解密切相關(guān)。Cristóbal等［26］證明mir-199b的表達(dá)與新輔助放化療療效有關(guān)。Du等［27］研究發(fā)現(xiàn)miR-548c-5p、miR-548d-5p和miR-663a與新輔助放化療后的完全緩解顯著相關(guān)。Campayo等［28］發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-99b和miR-375組合可預(yù)測(cè)新輔助放化療后的完全緩解與否。

3.長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）

lncRNA是長(zhǎng)度為＞200個(gè)堿基對(duì)的RNA，在基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和染色質(zhì)狀態(tài)等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。Yokoyama等［29］的研究提示lncRNA中的H19和UCA1可能參與了對(duì)5-FU的易感性，進(jìn)而與對(duì)新輔助放化療的敏感性相關(guān)。

4.基因表達(dá)譜

腫瘤組織的整體基因表達(dá)譜有可能識(shí)別與新輔助放化療反應(yīng)相關(guān)的基因信號(hào)。雖然研究的基因眾多，但目前發(fā)現(xiàn)主要與細(xì)胞增殖和凋亡［30-35］、腫瘤轉(zhuǎn)移［30-31］、細(xì)胞周期［32］、DNA修復(fù)［33，36］和細(xì)胞分化［36-37］相關(guān)（表2）。

表2 基因表達(dá)譜對(duì)結(jié)直腸癌新輔助放化療敏感性的預(yù)測(cè)

5.腫瘤免疫微環(huán)境

激活宿主免疫應(yīng)答在放化療的治療效果中起著重要作用，同時(shí)它也可以激活免疫抑制途徑。在腫瘤免疫微環(huán)境的影響因素中，CD8+TIL被研究最多，多數(shù)研究認(rèn)為新輔助放化療前較高的CD8+TIL與較差的病理反應(yīng)和預(yù)后相關(guān)［22，38-39］。

6.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）

MSI是指由于在DNA復(fù)制時(shí)插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度改變的現(xiàn)象，常由錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）功能缺陷引起，與癌癥發(fā)生有關(guān)，可用于癌癥檢測(cè)。Hasan等［40］的研究發(fā)現(xiàn)MSI（+）是一個(gè)降低病理完全緩解的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

7.DNA修復(fù)基因

基因組完整性的維持對(duì)正常細(xì)胞增殖和存活是至關(guān)重要的。而DNA修復(fù)失敗將會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和癌癥。因此DNA修復(fù)基因的表達(dá)失調(diào)很有可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)新輔助放化療的不良反應(yīng)。Jimenez等［41］的研究提示DNA修復(fù)基因表達(dá)差的患者更易產(chǎn)生對(duì)新輔助放化療的不良反應(yīng)。

三、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）

SNPs主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。Peng等［42］發(fā)現(xiàn)SNP中PTEN：rs12569998與對(duì)新輔助放化療的反應(yīng)顯著相關(guān)，PTEN雜合子：rs12569998對(duì)新輔助放化療的反應(yīng)優(yōu)于野生型基因型，AKT2：rs8100018與5年無(wú)病生存率（DFS）相關(guān)。AKT2雜合子：rs8100018患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低，5年無(wú)病生存率優(yōu)于野生型基因型患者，但還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有SNP與pCR顯著相關(guān)［42］。

四、印戒細(xì)胞癌（signet-ring cell carcinoma）

印戒細(xì)胞癌是一種含有大量黏液的癌細(xì)胞，黏液把細(xì)胞核擠向細(xì)胞的一側(cè)，其惡性程度高，預(yù)后較差。有研究發(fā)現(xiàn)新輔助放化療前的活檢樣本中的印戒細(xì)胞成分與較好的新輔助放化療反應(yīng)顯著相關(guān)，然而，關(guān)于印戒細(xì)胞癌對(duì)新輔助放化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，目前還缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)［43］。

五、小結(jié)與展望

盡管新輔助放化療在直腸癌中的應(yīng)用已十余年，但我們目前仍缺乏在治療前或治療早期區(qū)分對(duì)新輔助放化療耐藥患者和敏感患者的能力，從而指導(dǎo)對(duì)治療方案的適應(yīng)性修改。雖然目前已經(jīng)提出了許多分子生物標(biāo)記物作為新輔助放化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，然而還沒(méi)有一個(gè)達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)。而在直腸癌中缺乏預(yù)測(cè)新輔助放化療的生物標(biāo)志物可歸因于分子生物標(biāo)志物研究方法上的幾個(gè)問(wèn)題。

首先，大多數(shù)研究只評(píng)估了一種類型的生物標(biāo)記物，而沒(méi)有評(píng)估它們相對(duì)于其他標(biāo)記物的性能，并且它們自身的敏感性和特異性也不夠。因此，有必要比較和整合多種不同的生物標(biāo)記物（包括臨床病理和影像學(xué)特征），以對(duì)比它們之間的性能，從而開發(fā)出一種最佳的、可靠的生物標(biāo)志物模型，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)對(duì)新輔助放化療的反應(yīng)的生物標(biāo)志物模型。

第二，結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的疾病。并且一些研究表明CRC具有較高的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性［44］。基于這些發(fā)現(xiàn)，單一的生物標(biāo)志物不太可能達(dá)到足夠的敏感性和特異性來(lái)預(yù)測(cè)不同患者對(duì)新輔助放化療的敏感性，因此研究生物標(biāo)記物和腫瘤生物學(xué)之間的聯(lián)系機(jī)制，增加生物標(biāo)記物及其潛在局限性的大量信息，對(duì)我們能夠選擇與特定疾病亞型最相關(guān)的分子生物標(biāo)記物極為重要。

第三，使用不同的TRG系統(tǒng)也可能是研究中的潛在偏差。在本文所述的研究中使用了各種TRG系統(tǒng)。包括Mandard等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］提出的四種TRG系統(tǒng)。這些臨床變異性可能會(huì)增加統(tǒng)計(jì)分析所需的樣本數(shù)量，影響得出明確結(jié)論。因此，今后的研究應(yīng)嚴(yán)格設(shè)計(jì)有足夠數(shù)量的樣本，遵循相同的新輔助放化療方案和標(biāo)準(zhǔn)化的腫瘤應(yīng)答評(píng)價(jià)系統(tǒng)。

總之，盡管沒(méi)有預(yù)測(cè)分子生物標(biāo)志物對(duì)新輔助放化療有足夠的臨床效用，但是整合不同類型的生物標(biāo)志物包括臨床病理和影像學(xué)特性，以及腫瘤生物學(xué)的聯(lián)系機(jī)制的認(rèn)識(shí)或許可以開發(fā)出一種最佳的、可靠的生物標(biāo)志物模型，能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)對(duì)新輔助放化療的反應(yīng)。