基于特異性增強子的低級別膠質瘤分型研究

嚴光燦 田 偉 劉美娜

哈爾濱醫科大學公共衛生學院衛生統計教研室，150081 黑龍江 哈爾濱

腦膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤，按惡性程度可將其分為I～IV級[1]。由于患者異質性高，預后差異大，2016年新的分類標準增加了形態學和分子特征；2021年進一步增加了甲基化等特征[2-3]。臨床上II～III期的膠質瘤患者被統稱為低級別膠質瘤(lower grade glioma，LGG)，相對于I期和IV期膠質瘤，LGG患者的腫瘤異質性更高，如腫瘤微環境中的細胞成分及含量不同、預后差異大等[4-5]；即使病理類型相同的患者在接受相同治療后，治療結局仍有很大差異[6]，精準的分型有助于臨床醫生選擇更合理的治療方案。免疫相關基因(immune related genes, IRGs)異常與免疫浸潤、腫瘤發生發展、治療抵抗等過程息息相關，增強子對IRGs的表達有重要的調控作用。增強子是DNA序列上重要的遠端調控元件，其轉錄本稱為增強子RNA(enhancr RNA，eRNA)，eRNA含量可代表增強子的功能活性。增強子在各類腫瘤/正常組織中廣泛表達，而不同組織、癌癥間，其表達有明顯的特異性[7]。因此，研究特異性增強子調控的靶基因，有助于LGG患者精細、合理地分型；分析各型患者間的特征差異，對促進精準醫療實施、改善患者預后及相關機制研究具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 數據獲取與樣本篩選

從癌癥基因組圖譜數據庫(the cancer genome atlas, TCGA；www.xena.ucsc.edu/)獲取LGG患者的基因表達數據、臨床表型數據及預后生存數據作為訓練數據集；從中國膠質瘤基因組圖譜數據庫(chinese glioma genome atlas, CGGA；www.cgga.org.cn/)獲取相同類型數據作為驗證集。由于CGGA數據包括2個批次的數據，因此需要進行批次校正。增強子與靶基因的調控關系數據從eRNA數據庫(eRic；www.hanlab.uth.edu/eRic/)中獲取。并從ImmPort 數據庫(www.immport.org)和InnateDB數據庫(www.innatedb.com)中獲取IRGs，從MSigDB數據庫中獲取免疫相關通路基因集。樣本納入標準：(1)原發性腫瘤；(2)腫瘤分期為II～III期；(3)樣本含有基因表達數據、臨床表型數據及預后生存數據。

1.2 LGG分型分析

獲取LGG特異性eRNA，確定其調控的IRGs；利用IRGs對LGG樣本進行K-means聚類分析；聚類數設置為2～8，分析聚類熱圖的相關性，聯合手肘法，選取拐點處的值為最佳聚類數，確定LGG分型；利用CGGA數據進行相同分析，驗證聚類結果的穩健性。聚類分析通過R包“ConsensusClusterPlus”實現。

1.3 免疫浸潤與通路富集分析

腫瘤微環境中免疫細胞浸潤對腫瘤進展、藥物敏感性及患者預后有重要影響。利用“CIBERSORT”算法對做LGG患者進行免疫浸潤分析，比較各亞型間免疫細胞浸潤模式的差異[8]。富集分析探索特異性增強子調控的IRGs所參與的生物學過程，包括KEGG富集分析、GO富集分析。分析結果利用R包“clusterProfiler”實現。

1.4 臨床特征分析

生存分析比較各亞型間患者生存時間差異， log-rank檢驗對差異進行統計推斷，并繪制生存曲線。檢驗分析各型間腫瘤分期、TERTp突變、MGMTp甲基化、IDH突變、染色體1p/19q共缺失的構成差異。秩和檢驗分析各亞型間基因突變數、TERT基因表達量的差異。

1.5 基因集差異分析

基于免疫相關通路基因集的基因集差異分析(gene set variation analysis，GSVA)：計算每個樣本的通路富集得分(得分大于0表示通路活性上調，小于0表示通路活性下調)，比較各型間的通路活性差異，定義|logFC| > 0.5且校正P<0.05的通路為亞型間的差異通路。GSVA利用R包“GSVA”完成。

2 結果

2.1 特異性增強子調控的靶基因篩選

納入排除標準選擇得到訓練集495個樣本、驗證集426個樣本。篩選出227個LGG特異性增強子，50個特異性增強子調控的免疫相關性靶基因，包括AKT2、HIF1AN、LRSAM1、PTCH1等。

2.2 LGG分型

TCGA樣本聚類發現聚類數為5時效果最好，組內相關性高，組間相關性低(圖1A)；手肘法結果顯示,拐點處值的為5(圖1B)，確定最佳聚類數為5類。驗證集CGGA樣本聚類分析后得到相同結果，表明聚類結果穩定。LGG分為5型，分別記為A1～A5亞型，其構成比分別為 22.6%、21.6%、13.7%、26.3%和15.8%。

A:K-means聚類熱圖；B:手肘法結果

2.3 免疫浸潤分析

免疫浸潤分析結果顯示：不同亞型患者間免疫細胞浸潤模式不同；22種免疫細胞中有18種在各亞型間存在明顯差異(P<0.05)。見圖2。其中，A1亞型患者主要富集M2型巨噬細胞、活化型肥大細胞及單核細胞；A2型富集M2型巨噬細胞；A3型富集嗜酸性粒細胞、活化型NK細胞，M2型巨噬細胞含量最低；A4型富集單核細胞和M2型巨噬細胞；A5型富集M1、M2型巨噬細胞，靜息型CD4記憶T細胞和CD8+T細胞，單核細胞和NK細胞含量最低。

注:*P<0.05；**P <0.01；***P<0.001。

2.4 富集分析

GO富集分析發現IRGs主要參與c-Jun-氮末端激酶(JNK)活性調節、多種細胞分化(如脂肪細胞、白細胞)、造血功能調節以及多種酶活性調節(如內切酶、蛋白酶)、受體配體活性、蛋白/組蛋白脫乙酰基酶活性等多條信號通路(圖3A)。KEGG結果顯示IRGs主要參與酒精性肝病、多種病原體感染(如沙門氏菌、志賀桿菌、人免疫缺陷病毒)以及cAMP等多種生物學過程(圖3B)。

A:GO富集分析結果；B:KEGG富集分析結果

2.5 臨床特征分析

生存分析結果顯示A5亞型預后最差，中位生存期約為2年，其余亞型間預后生存無統計學差異。見圖4A。A3和A4組療效最好，超過60%的患者治療有效；A5組療效最差，超過30%的患者出現病情進展。見圖4B。A5組III期患者比例最高，其次是A2，A3組最低。見圖4C。IDH基因突變、MGMTp甲基化均表現為在A5組比例最低，其余各組較高；TERTp突變在A5組最高，A2組次之，最低是A1組；染色體1p/19q共缺失在A2最高，A5最低。見圖4D～4G。總突變數在A5組最高，平均突變數約為40，A3組最低，平均突變數不到20；TERT基因表達在A2和A5組最高，A1和A4組最低。見圖4H、圖4I。

A：生存分析結果；B：療效構成比；C：分期構成；D：1p/19q共缺失構成；E：IDH突變構成；F： MGMTp甲基化構成；

2.6 基因集差異分析

GSVA結果發現115條差異通路，選擇|logFC|最大的前20條通路進行可視化后發現，這些通路在A5組患者中均過度激活，在A3組患者中活性則均受到抑制，其余3組活性無明顯差別。見圖5。

3 討論

隨著醫療技術發展，許多疾病的療效均顯著提升，但由于LGG患者腫瘤異質性高、個體差異大，療效提升有限。對LGG患者進行精準的分型，針對不同亞型患者選擇不同的治療方案，有利于提升治療效果、改善患者預后。以往的LGG分型研究由于缺乏特異性的標志物，分型效果不理想。增強子有高特異性，且可直接影響腫瘤的發生發展，對LGG患者精準分型有重要意義。本研究通過篩選特異性增強子調控的IRGs獲得5個LGG亞型，各型間生存、臨床特征、基因通路活性及免疫浸潤模式等存在顯著差異。但增強子對基因的調控作用能多大程度影響患者預后仍需進一步探索，后續研究需在本研究的基礎上深入探索，并利用實驗驗證機制假設。

在腫瘤微環境中，除腫瘤細胞外，還存在大量的免疫細胞、基質等非腫瘤細胞成分。免疫細胞浸潤模式的不同對腫瘤發生進展、藥物敏感性及患者預后有重要影響。M2型巨噬細胞可促進腫瘤細胞免疫逃逸、加快腫瘤進展和轉移[9]；本研究顯示A5組M2型巨噬細胞浸潤程度最高，這表明A5的不良預后可能與M2型巨噬細胞引起的免疫逃逸有關。單核細胞可分化為巨噬細胞，主要包括M0、M1、M2 3個亞型，其中M0對免疫逃逸有抑制作用，M1和M2則可促進腫瘤細胞的免疫逃逸[10]。預后最差的A5組單核細胞含量最低，說明單核細胞可能更多地分化為抑制免疫逃逸的M0型巨噬細胞；免疫細胞的分化可能對LGG患者的生存結局有重要影響。本研究發現免疫細胞成分和含量不同，會導致患者間預后差異很大，這與各免疫細胞的功能不同有關，但具體的機制有待后續的實驗加以佐證。

圖5 GSVA差異活性通路

GSVA結果顯示各型間多條信號通路活性有顯著差異，表明各組間預后及療效差異可能與這些通路活性不同有關。c-Jun-氮末端激酶(JNKs)是一類蛋白激酶家族，在細胞增殖分化、衰老凋亡等生物學過程中發揮重要作用[11]。本研究篩選的靶基因富集在多條與JNKs活性調節相關的通路，這提示JNKs相關通路可能是影響LGG患者療效與生存的重要通路；A5亞型預后差可能與JNKs相關通路失調導致細胞增殖分化紊亂、癌細胞異常增殖有關。此外，這些靶基因還參與多種細胞分化、造血功能調節等生物學過程，均是與癌細胞增殖、癌組織生長相關的關鍵通路。

各型間臨床分期存在顯著差異，A5亞型III期患者比例最高，與其預后最差相一致；其余亞型間分期也存在明顯差異，生存結局卻無顯著差異，說明除腫瘤分期外，還有其他因素影響LGG患者生存，也說明進行LGG分型十分必要。結果顯示：TERTp突變比例高，IDH突變、1p/19q聯合缺失、MGMTp甲基化比例低的患者預后差，這與以往的研究結果相一致[2,12-13]。A2組III期患者占比及TERTp突變比例都僅次于A5，但生存卻與其余各組無差異，很可能與A2組患者1p/19q共缺失比例最高有關。

綜上，本研究獲得多個特異性增強子和其參與調控IRGs；共獲得5個LGG亞型且分型結果穩定，可為臨床治療提供參考；不同亞型患者間預后生存、免疫浸潤模式、通路活性、臨床及分子特征存在統計學差異，可為相關機制研究提供參考。