轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血及腫瘤組織RAS 基因突變一致性對(duì)西妥昔單抗治療療效的影響*

王永洪 王健 賀萬斌 付榆 但杰 朱明杰

（四川省樂山市人民醫(yī)院 樂山 614000）

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，具有發(fā)病率高、致死率高等特點(diǎn)[1]。目前，臨床上治療CRC 以手術(shù)切除根治為主，雖然能切除病灶組織，但是30%以上患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，即發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）（肝臟是CRC 血行轉(zhuǎn)移主要靶器官），mCRC 成為我國(guó)居民死亡的重要原因。mCRC 治療中，借助單克隆抗體西妥昔單抗或帕尼單抗能競(jìng)爭(zhēng)性阻斷表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和其他配體的結(jié)合，抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[2]。循環(huán)游離DNA（cfDNA）是一種天然存在于血細(xì)胞中的物質(zhì)，且越來越多的研究證實(shí)，實(shí)體瘤的基因突變可能是由攜帶循環(huán)腫瘤DNA 的癌癥細(xì)胞進(jìn)入血漿引起。本研究以mCRC 患者為研究對(duì)象，探討mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS 基因突變一致性對(duì)西妥昔單抗治療療效的影響。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年5 月～2018 年12 月收治的mCRC 患者69 例作為研究對(duì)象，男37 例，女32 例，年齡20～84 歲，平均（57.85±5.79）歲；原發(fā)腫瘤部位：左半結(jié)直腸51 例，右半結(jié)腸18 例；轉(zhuǎn)移類型：同時(shí)性48 例，異時(shí)性21 例；腹膜轉(zhuǎn)移：有9例，無60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合mCRC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)檢查確診；（2）腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶部位明確；（3）均處于姑息性一線或二線化療；（4）具備一個(gè)可用的mCRC 用于腫瘤組織突變分析診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）精神異常、凝血功能異常或認(rèn)知功能異常者；（2）血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎功能異常或伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有患者的腫瘤組織均采用石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)處理，腫瘤組織區(qū)域的選擇由病理學(xué)專家評(píng)估。同時(shí)應(yīng)考慮腫瘤組織標(biāo)準(zhǔn)化所需樣本量。外周血血漿和血液中制備標(biāo)本如下：入組患者借助DETA 管采集血漿10 ml，60 min 離心，采用兩步血液離心操作進(jìn)行10 min 離心，速度1 600 rpm，操作完畢后采集上清；將剩余的細(xì)胞在室溫下完成10 min 離心，速度3 000 rpm，血漿上清轉(zhuǎn)移到EP 管1.5 ml 中，儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，備用。所有患者腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行突變分析，并由醫(yī)院病理科專家評(píng)估、確認(rèn)腫瘤細(xì)胞數(shù)；10 μm 切片制備前，56℃下利用二甲苯、乙醇提取物對(duì)脫蠟面積＞15%腫瘤組織進(jìn)行過夜，并給予蛋白酶K 消化。

1.2.2 RAS 基因突變分析 采用放射免疫法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)血漿和腫瘤組織進(jìn)行RAS狀態(tài)檢測(cè)。從mCRC 患者中的組織中提取DNA，并完成相關(guān)檢測(cè)；采用放射免疫法評(píng)估RAS 基因突變情況。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，可查詢歷史RAS 檢測(cè)報(bào)告，若組織可用，再轉(zhuǎn)移時(shí)利用SOC 技術(shù)再次完成RAS 基因檢測(cè)。（1）DNA 純化。借助循環(huán)核酸試劑盒完成DNA 的提取、純化。采用DNA 純化試劑盒完成FFPE 樣品提取與自動(dòng)化系統(tǒng)maxwell16 FFPE 濃度測(cè)定。采用Nanodrop 1000 分光光度儀完成DNA 濃度提取。（2）腫瘤組織中ctDNA 的BEAMing 技術(shù)。從2 ml 血漿中獲得檢測(cè)樣本，利用oncobeam RAS CR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。利用流式細(xì)胞儀獲得的數(shù)據(jù)通過FCS Express TM 軟件進(jìn)行分析；突變率＞0.02%～0.04%的樣品為陽性。采用熒光標(biāo)記探針完成敏感基因位點(diǎn)的檢測(cè)，并利用流式細(xì)胞儀獲得實(shí)時(shí)熒光定量（PCR）相關(guān)產(chǎn)物，采用FCS Express 軟件比較突變體與野生型等位基因的比例；突變率在1%以上為陽性[3]。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè) （1）總RNA的提取。向樣品中加入200 μl 氯仿，15 s 振蕩后進(jìn)行15 min 離心，速度4 500 rpm。離心完畢后去除上清，加入預(yù)冷乙醇1 ml，常溫下干燥7 min；在A260吸光值下完成總RNA 測(cè)定。（2）檢測(cè)。采用PCR 法測(cè)定RAS 基因突變位點(diǎn)，50 ng 的DNA 被用于外部引物擴(kuò)增，95℃下連續(xù)完成14 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30 s，根據(jù)相應(yīng)的溫度下進(jìn)行30 s 退火，最后在72℃下完成RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增30 s。擴(kuò)增的DNA 作為PCR 模板，點(diǎn)突變分析的引物用于探針的檢測(cè)[4]。

1.2.4 治療方法及RAS 基因?qū)Ο熜У挠绊?患者均采用西妥昔單抗治療，初始劑量西妥昔單抗注射液（注冊(cè)證號(hào)S20130004）400 mg/m2，靜脈滴注，之后每周用藥250 mg/m2，每4 天重復(fù)給藥。療程結(jié)束后完成30 個(gè)月隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0 軟件處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用%表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mCRC 患者RAS 基因突變檢測(cè)分析 69 例mCRC 患者均完成RAS 基因突變檢測(cè)，結(jié)果表明：患者中RAS 基因突變26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突變型患者9 例，占34.62%。其中，12 號(hào)密碼子GGT 突變?yōu)镚TT 10 例，突變?yōu)镚AT 8 例；突變?yōu)锳GT、CGT、TGT、GCT 患者1 例；13 號(hào)密碼子GGC 突變?yōu)镚AC 3 例，突變?yōu)門CG 4例。見圖1。

圖1 mCRC 患者RAS 基因突變位點(diǎn)

2.2 mCRC 患者外周血及腫瘤組織中RAS 基因突變一致性分析 所有患者均完成外周血及組織中RAS 基因突變檢測(cè)，結(jié)果表明：mCRC 患者組織中RAS 基因突變檢出率高于外周血中（P＜0.05）。見表1。

表1 mCRC 患者外周血及腫瘤組織中RAS 基因突變一致性分析

2.3 不同RAS 基因突變類型mCRC 患者西妥昔單抗療效分析 對(duì)所有mCRC 患者均常規(guī)給予西妥昔單抗治療，并對(duì)患者進(jìn)行30 個(gè)月隨訪，結(jié)果表明：mCRC 患者中野生型患者利用西妥昔單抗后患者平均生存期為（21.49±5.64）個(gè)月，長(zhǎng)于突變型患者的（16.23±3.59）個(gè)月（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同RAS 基因突變類型mCRC 患者西妥昔單抗生存期比較

3 討論

腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，RAS 基因則是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）依賴的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras-Raf-MAPK 途徑的重要基因。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明，所有mCRC 患者均應(yīng)進(jìn)行KARS 基因狀態(tài)檢測(cè)，且只有KRAS 野生型患者臨床建議接受EGFR 抑制劑治療[5]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)常伴有遺傳物質(zhì)的釋放，造成血中存在游離的腫瘤DNA，且與原發(fā)腫瘤遺傳信息相同。同時(shí)，RAS基因的測(cè)定以外周血、組織測(cè)定為主，但是臨床上對(duì)其一致性存在爭(zhēng)議。本研究中，患者中RAS 基因突變26 例，RAS 基因野生型患者17 例，占65.38%，突變型患者9 例，占34.62%。其中，12 號(hào)密碼子GGT突變?yōu)镚TT 10 例，突變?yōu)镚AT 8 例；突變?yōu)锳GT、CGT、TGT、GCT 1 例；13 號(hào) 密碼子GGC 突變?yōu)镚AC 3 例，突變?yōu)門CG 4 例，說明RAS 基因在mCRC 患者中突變率較高，且突變類型較多，均會(huì)增加臨床診療難度。循環(huán)腫瘤DNA 主要源于腫瘤細(xì)胞自主分泌、壞死及凋亡后的DNA 片段，其片段上常攜帶突變信息。本研究中，mCRC 患者組織中RAS 基因突變檢出率高于外周血中（P＜0.05），可以看出mCRC 患者病灶組織中RAS 基因突變率高于外周血中，對(duì)于難以獲得結(jié)直腸癌組織或耐藥突變?nèi)巳海蓽y(cè)定外周血中循環(huán)腫瘤DNA[6]。西妥昔單抗屬于一種針對(duì)EGFR 的人鼠嵌合單克隆抗體，主要由鼠的抗EGFR 抗體可變區(qū)和人的IgG1 重鏈與κ 輕鏈的恒定區(qū)組成，藥物與EGFR 具有較強(qiáng)的親和力，能阻斷EGF、EGFR 結(jié)合，引起下游酪氨酸激酶活性降低，阻止腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)揮腫瘤細(xì)胞殺傷作用。本研究結(jié)果說明mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS 基因突變類型會(huì)對(duì)西妥昔單抗治療效果產(chǎn)生影響，治療前應(yīng)加強(qiáng)患者RAS 基因測(cè)定，制定詳細(xì)的治療方案，使得患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，mCRC 患者外周血及腫瘤組織RAS基因突變存在一定的差異，會(huì)對(duì)患者西妥昔單抗治療療效產(chǎn)生一定影響，應(yīng)根據(jù)RAS 基因突變類型制定針對(duì)性治療方案，提高治療療程。