HR-HPV E6/E7 mRNA與HPVL1蛋白檢測對早期宮頸癌的診斷價值探討

沈曉斌 王寧 侯明生 詹瑩

[摘要] 目的 探討HR-HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白在早期宮頸癌及宮頸上皮病變中的臨床意義。 方法 收集2018年6月至2019年5月本院150例患者資料，按宮頸病變程度分為低級別組（n=69）、高級別組（n=29）、宮頸癌組（n=9）和正常組（n=43）四組，同時檢測患者HR-HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白表達情況，觀察兩者的相關性，并比較多種篩查方案的優越性。 結果 低級別組（81.16%）、高級別組（86.21%）、宮頸癌組（100.00%）HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于正常組（11.63%），且HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率隨著病變的級別升高而遞增，呈顯著正相關（r=0.736，P<0.05）。同時，低級別組（36.23%）、高級別組（31.03%）、宮頸癌組（11.11%）HPVL1蛋白陽性率均低于正常組（74.42%），發現HPVL1蛋白陽性率隨著病變級別升高而遞減，呈顯著負相關（r=-0.521，P<0.05）。統計并分析液基細胞學、HR-HPV E6/E7 mRNA、HPVL1蛋白檢測方法及聯合檢測在宮頸病變中的診斷價值。發現聯合檢測特異度最高（93.02%），且敏感度較高（74.76%）。 結論 HR-HPV E6/E7 mRNA檢測是宮頸癌篩查的有效措施之一，HPVL1蛋白檢測在宮頸癌篩查中有重要意義。比較HR-HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白檢測結果在宮頸癌篩查中有重要的指導作用，可避免過度治療。

[關鍵詞] 乳頭狀瘤病毒科;宮頸腫瘤;HPVL1蛋白;HR-HPV E6/E7 mRNA

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）36-0128-05

Investigation of the detection value of HR-HPV E6/E7 mRNA and HPVL1 protein in diagnosis of early cervical cancer

SHEN Xiaobin? ?WANG Ning? ?HOU Mingsheng? ?ZHAN Ying

Department of Pathology， Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine in Zhejiang Province， Shaoxing? ?312000， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of HR-HPV E6/E7 mRNA and HPVL1 protein in early cervical cancer and cervical epithelial lesions. Methods The data of 150 patients in our hospital from June 2018 to May 2019 were collected and divided into the low-grade group （n=69）， the high-grade group （n=29）， the cervical cancer group （n=9） and the normal group （n=43） according to the degree of cervical lesions. At the same time， the patients′ expressions of HR-HPV E6/E7 mRNA and HPVL1 protein were detected， and the correlation between them was observed， and the advantages of various screening schemes were compared. Results The positive rates of HR-HPV E6/E7 mRNA in the low-grade group （81.16%）， the high-grade group （86.21%） and the cervical cancer group （100.00%） were higher than that in the normal group （11.63%）， and the positive rate of HR-HPV E6/E7 mRNA increased with the increase of pathological grade， showing a significant positive correlation （r=0.736， P<0.05）. Meanwhile， the positive rate of HPVL1 protein in the low-grade group （36.23%）， the high-grade group （31.03%） and the cervical cancer group （11.11%） was all lower than that in the normal group （74.42%）. It was found that the positive rate of HPVL1 protein decreased with the increase of pathological grade， showing a significant negative correlation （r=-0.521， P<0.05）. The diagnostic value of liquid-based cytology， HR-HPV E6/E7 mRNA， HPVL1 protein detection method and combined detection in cervical lesions was counted and analyzed. It was found that the combined detection had the highest specificity （93.02%） and higher sensitivity （74.76%）. Conclusion Detection of HR-HPV E6/E7 mRNA is one of the effective measures in cervical cancer screening， and detection of HPVL1 protein is of great significance in cervical cancer screening. Comparing the detection results of HR-HPV E6/E7 mRNA and HPVL1 protein plays an important guiding role in cervical cancer screening， which can avoid over-treatment.

[Key words] Papillomaviridae; Cervical cancer; HPVL1 protein; HR-HPV E6/E7 mRNA

宮頸癌仍然是當代發展中國家女性的第三大常見惡性腫瘤，居女性癌癥死因第4位，85%以上新發及死亡病例出現在發展中國家。近年來，我國的臨床宮頸癌發病率呈現上升趨勢，其發病的年齡也愈發趨于年輕化。我國占全球宮頸年度發病率的14%，死亡率的12%[1-3]。2015年，全國城市平均宮頸癌篩查率僅為31.5%，其中沿海經濟發達地區約為35.9%[4]。HPV感染是全球最常見的性傳播疾病，高危型HPV的持續性感染是宮頸癌的主要病因[5-6]。目前HPV檢測的方法眾多，不同檢測方法在宮頸癌前病變中的表達存在一定的差異[7]。本研究主要探討HR-HPV E6/E7 mRNA檢測、HPVL1蛋白檢測在早期宮頸癌篩查中的臨床價值及其重要意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集紹興市中醫院2018年6月至2019年5月因患宮頸疾病來院進行陰道鏡下宮頸活檢檢查的150例患者資料，根據病理活檢結果[8]分為四組，低級別宮頸上皮內瘤變患者69例（低級別組），年齡19～65歲，平均（33.5±9.5）歲;高級別宮頸上皮內瘤變患者29例（高級別組），年齡21～60歲，平均（39.3±8.9）歲;宮頸浸潤癌患者9例（宮頸癌組），年齡29～64歲，平均（44.6±7.8）歲;黏膜慢性炎患者43例患者（正常組），年齡24～69歲，平均（34.3±9.3）歲。四組患者年齡比較，差異無統計學意義（F=1.336，P>0.05），具有可比性。

1.2 實驗試劑及實驗儀器

1.2.1 婦科宮頸液基細胞學（Liquid-basedcytologytest，LBP）檢查? 使用美國豪洛捷液基細胞學（Thinprep cytologic test，TCT）試劑耗材及配套儀器進行細胞學檢查，采用世界衛生組織（World Health Organization，WHO）（2017版）規范TBS（The Bethesda System）診斷報告，其結果判斷為無上皮內病變或惡性病變（NILM）時定義為陰性，當判讀為無明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）及以上時定義為陽性。

1.2.2 HPVL1蛋白檢測? 采用核酸和免疫水平雙重檢測法檢測傳染病原體HPVL1蛋白抗體。采用試劑主要為美國愛迪旺斯醫療科技有限公司生產的賽泰HPVL1蛋白檢測試劑盒。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.3 HR-HPV E6/E7 mRNA檢測? 采用轉錄介導擴增（Transcription-mediated amplification，TMA）的靶擴增法檢測14種高危型HPV的E6、E7mRNA片段。檢測試劑主要為美國豪洛捷公司生產的Aptima HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.3病理學診斷

陰道鏡檢查與病理學診斷：由有經驗的婦科醫生操作，于病變典型處多點取材活檢，病理組織學診斷[8]按WHO診斷標準分類為正常、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變和宮頸癌，病理細胞學診斷[8]按WHO診斷標準分類為正常（NILM）、無明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）、非典型鱗狀上皮細胞傾向于高級別上皮內瘤變（ASCU-H）、低級別上皮內瘤變（LSIL）、高級別上皮內瘤變（HSIL）和宮頸癌（SCC）。所有診斷均有兩名以上高年資主治以上醫生判別。

1.4標本采集及方法

使用豪洛捷液基細胞學（TCT）檢測專用采集刷收集宮頸口及宮頸管的脫落上皮細胞，擰斷刷頭放入專用保存液瓶中待檢。

1.4.1 宮頸液基細胞學（LBP）涂片制作? 取保存液標本5 mL加入豪洛捷超薄層液基細胞制片機中，制成液基細胞涂片后進行巴氏染色，儀器、試劑耗材均購自美國豪洛捷公司。

1.4.2 標本篩取? 采取對照有宮頸病理活檢結果的病例進行下一步實驗，病理活檢檢查分類按WHO（2017版）規范化診斷分類[8]。

1.4.3 HPVL1蛋白檢測? 取TCT檢查制片后的剩余標本5 mL再做一張白片，采用核酸和免疫水平雙重檢測傳染病原體HPVL1蛋白抗體的方法進行HPVL1蛋白檢測，采用HPVL1蛋白檢測試劑盒。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.4.4 HR-HPV E6/E7 mRNA檢測? 取上述處理后剩余的TCT檢查標本進行，采用轉錄介導擴增的靶擴增法檢測14種高危型HPV的E6、E7mRNA片段（TMA）的技術，具體操作為：①先提取高危型HPV E6/E7 mRNA，然后在逆轉錄酶的作用下，利用一對靶序列特異性引物與靶序列結合后，進行逆轉錄反應，形成RNA DNA的雜交分子。②逆轉錄酶水解RNA DNA雜交分子，形成單鏈DNA，含有T7 RNA聚合酶的識別啟動子序列。③單鏈DNA和引物2結合，通過逆轉錄方式合成雙鏈DNA分子。T7 RNA聚合酶在啟動子上聚合，然后以DNA分子為模板進行轉錄，作為TMA檢測的起始模板，重復以上步驟。④反應完成后，可應用雜交保護試驗（Hybridization protection assay，HPA）對生成的RNA產物進行檢測[9]。首先檢測HPV 16/18 的E6/E7 mRNA，然后若陰性再檢測其他12種高危型HPV E6/E7 mRNA。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較調整采用方差分析，計數資料采用[n（%）]表示，使用χ2檢驗，兩變量的相關分析用Pearson直線相關分析法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同檢測分布情況

低級別組、高級別組及宮頸癌組HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于正常組，HPVL1蛋白檢測陽性率均低于正常組，且后兩組HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率均高于低級別組和正常組，HPVL1蛋白檢測陽性率均低于低級別組和正常組;低級別組、高級別組和宮頸癌組HR-HPV E6/E7 mRNA陽性率隨著病變級別升高而遞增，呈顯著正相關（r=0.736，P<0.05），HPVL1蛋白檢測陽性率隨著病變級別升高而遞減，呈顯著負相關（r=-0.521，P<0.05）。見表1。

正常組HR-HPV E6/E7 mRNA檢測結果陽性率分別低于低級別組、高級別組、宮頸癌組，差異均有統計學意義（低級別組χ2=51.641，P<0.05;高級別組χ2=39.630，P<0.05;宮頸癌組χ2=25.222，P<0.05）。表明HR-HPV E6/E7 mRNA在宮頸上皮不同病變中的表達存在差異。

正常組HPVL1蛋白檢測結果陽性率分別高于低級別組、高級別組、宮頸癌組，差異均有統計學意義（低級別組χ2=15.462，P<0.05;高級別組χ2=13.298，P<0.05;宮頸癌組χ2=10.280，P<0.05）。表明HPVL1蛋白在宮頸上皮病變中存在差異性，HPVL1檢測顯示細胞核染色陽性見封三圖16A、B。

2.2各組不同檢測方法在宮頸上皮病變中的結果比較

各種檢測方法敏感度、特異度比較，差異有統計學意義（均P<0.05），其中HR-HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白聯合檢測特異度最高。各種檢測方法陽性預測值和陰性預測值比較，差異無統計學意義（均P>0.05）。見表2。其中聯合檢測特異度最高（93.02%）。HR-HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白檢測在高級別及以上宮頸病變中的ROC曲線分析見圖1。

3討論

3.1 目前宮頸癌篩查國內外現狀

美國等發達國家由于人們對自身健康的重視、完善的宮頸癌前篩查體系及宮頸癌疫苗的研發普及，患宮頸癌及因宮頸癌死亡的病例每年呈下降趨勢[10]。中國等發展中國家，近年來宮頸癌的發病率及死亡率都呈現了上升趨勢，且年齡愈發趨向年輕化[11]。在歐美等發達國家，HPV疫苗已經進入普及狀態，但HPV疫苗的結果顯現尚需時間，其臨床效用尚待有效數據驗證，而在中國等發展中國家，HPV疫苗剛進入推廣狀態，其臨床效用更是需要時間。且注射疫苗后不等于不用進行宮頸癌篩查。中國醫療資源分布差異較大，目前國內HPV的檢測產品數量眾多，因生產廠家不同，原理不同，質量也參差不齊，且缺乏統一的判定標準和充分的臨床數據驗證支持，必然導致檢測結果的差異。目前HPV檢測在婦科臨床應用主要為單獨篩查宮頸癌、與細胞學聯合篩查宮頸癌、細胞學篩查后結果異常的分流、治療后的隨訪、篩查異常后的隨訪等[12]。

細胞學檢查具有較高的特異性，是診斷宮頸癌前病變的金標準之一。但由于細胞學病理診斷醫師培養周期長，導致醫生資源匱乏、診斷水平參差不齊。且各實驗室的基礎條件不同，實驗室間的結果也會存在較大的差異。在臨床實際操作中，受限于標本取樣，鏡下觀察主觀性強等原因，存在了許多現實問題，如細胞學敏感性較低，重復性較差，對腺上皮病變不敏感，無明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）在異常細胞學檢查中占50%以上，不能明確是癌前病變還是反應性細胞改變。有文獻報道，在大樣本人群篩查中ASC-US為5%～10%[13]。有研究顯示，ASC-US病例中最終被明確診斷為高級別上皮內瘤變<10%，被確診為浸潤性癌的僅為0.1%左右[14]。腺上皮病變有隱匿性，約有60%的子宮頸原位腺癌為不典型病變，極易漏診，大約有37%的子宮頸原位腺癌是在手術治療HSIL時意外發現的。

由此，選擇一種較為合理的檢查方案，既能在不失其高敏感性的同時，提高其特異性，又能不增加患者的醫療負擔，同時避免過度檢查，減少醫療資源的浪費，顯得十分重要。

3.2 HR-HPV E6/E7 mRNA、HPVL1蛋白檢測與宮頸癌的相關性

Ou等[15-16]在研究HR-HPV DNA時發現，宮頸病變上皮細胞中致癌基因E6、E7蛋白存在異常表達，可以促進細胞病變的進展。有研究證實，高危型HPV E6/E7 mRNA相對于HR-HPV DNA對高級別及以上病變有更高的特異性，認為其為病毒持續性感染和持續復制的生物標志物，提示病毒癌基因已經轉錄表達，主要用于評估宮頸癌變的風險與預后[17]。本研究結果顯示，與宮頸正常組織病例比較，存在宮頸病變病例有較高的HR-HPV E6/E7 mRNA 陽性表達率。相關數據表明，組織細胞學診斷病變級別越高，HR-HPV E6 /E7 mRNA表達陽性率越高。

HPV分子結構為雙鏈環狀DNA分子，包括了6個與DNA復制、細胞轉化有關的基因（E1、E2、E4、E5、E6、E7）和 2個編碼病毒衣殼蛋白的基因（L1、L2），其中病毒衣殼蛋白基因表達的病毒衣殼蛋白L1為病毒主衣殼蛋白。HPVL1蛋白在宮頸病變上皮細胞中異常表達。有研究證實，HPVL1蛋白表達水平能夠反映細胞中病毒的復制狀態、宮頸病變的進展程度[18]。HPVL1蛋白檢測陽性說明存在一過性HPV感染階段，HPVL1蛋白的缺失說明HPV感染持續存在或已發生顯著病變[19]。本研究發現，組織細胞學診斷病變級別與HPVL1蛋白表達陽性率呈顯著負相關（P<0.05），組織細胞學診斷病變級別越高，HPVL1蛋白表達陽性率越低。由于受限于本課題研究內容，尚不能闡述本研究中正常對照組HPVL1蛋白陽性率表達較高的原因，此問題尚有待進一步探討。

3.3 HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白檢測有良好的臨床應用前景

HR-HPV檢測的特點是敏感性高，可達90.8%，但缺點是特異度低，其檢出高級別上皮內病變的特異度約為44.8%[20]。目前，高危型HPV的檢測更多應用于高收入國家，而我國目前的高危型HPV檢測相關試劑多達70余種，多數產品缺乏子宮頸癌篩查的臨床數據及隨訪數據的支持，且缺乏嚴格的室內、室間質量控制，這必然影響其篩查結果的準確性。趙雪蓮等[12]研究顯示，高危型HPV分型檢測敏感度為96.4%，特異度為86.2%，陽性預測值為18.6%，陰性預測值為99.9%。本研究中分別統計了TCT、HR-HPV E6/E7 RNA、HPVL1蛋白檢測方法及聯合檢測在宮頸病變中的診斷價值。結果發現，各種檢測方法敏感度、特異度比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中聯合檢測特異度最高（93.02%），且敏感度較高（74.46%），明顯優于單獨應用高危型HPV分型檢測結果。各種檢測方法陽性預測值和陰性預測值比較，差異無統計學意義（P>0.05），表明聯合檢測方法在鑒別宮頸病變，尤其是針對HPV持續感染導致宮頸癌高風險預期，有較高的特異度。

HPVL1蛋白檢測屬于病原學檢測，可顯示HPV感染后的不同階段。HPVL1蛋白檢測陽性說明存在或曾經存在過一過性HPV感染，HPVL1蛋白陰性說明HPV的感染持續存在;HR-HPV E6/E7 mRNA是新一代HR-HPV檢測方法，為病毒持續性感染和持續復制的生物標志物，是評估宮頸病變嚴重程度并預測其預后的重要因素。比較HPVL1蛋白檢測與HR-HPV E6/E7 mRNA檢測結果具有十分重要的臨床意義。

在歐美等發達國家，HPV疫苗已經普及覆蓋，隨著時間的推移，在疫苗作用下HPV的型別，致病亞型均已發生極大的變化，如宮頸癌發生率降低，死亡率降低，16/18型HPV感染者大大減少等[21]。我國HPV疫苗自2018年開始使用，但即使所有12歲以下的女孩都注射了疫苗，最樂觀的講也要30年才能單靠接種預防宮頸癌，且疫苗只覆蓋部分高危型HPV，因此現在的幾十年中仍主要靠篩查預防宮頸癌。從另一方面來說，注射HPV疫苗不等于不需要進行宮頸癌篩查，注射HPV疫苗后，篩查可成為宮頸癌的第二道防線，進一步降低宮頸癌發病風險。并且，在宮頸癌后疫苗時代下，對各種HPV亞型的檢測及致病性有必要進行重新評估論證，如16/18型HPV感染者大大減少導致其他12種高危型HPV 檢出比率會相對增多，對原來14種高危型HPV 的依次重要性必然會有一個重新排序的過程。HR-HPV E6/E7 mRNA檢測對比HPVL1蛋白檢測可在病原學基礎上重新排序14種高危型HPV 的依從性，在后疫苗時代下有十分重要的臨床研究意義。

綜上所述，HR-HPV E6/E7 mRNA檢測和HPVL1蛋白檢測具有高特異性和高敏感性的特點，在臨床有十分重要的意義。可有效地避免過度檢查、治療，節約寶貴的醫療資源，可以減輕患者的心理負擔，并具有極大的社會經濟學效益。兩者有機結合，更有利于綜合評估患者發生宮頸病變的風險，具有良好的臨床應用前景。

[參考文獻]

[1] Chen WQ，Zheng RS，Baade PD，et al.Cancer statics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[2] Wang N，Hou MS，Zhan Y，et al.MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the PI3K/AKT pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018， 22（11）：7653-7659.

[3] 沈曉斌，包磊，詹瑩.HPV檢測在宮頸癌前病變篩查策略中的作用探討[J].中國婦幼健康研究，2018，29（10）：1345-1348.

[4] 許惠惠，石衛武，徐玖飛，等.HPV基因分型在宮頸癌篩查風險分層管理中的價值[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2016，30（1）：14-18.

[5] 王慶華，趙方輝，趙昀，等.子宮頸癌等人乳頭瘤病毒相關疾病免疫預防專家共識[J]. 中華預防醫學雜志，2019， 53（8）：761-803.

[6] Depuydt CE，Thys S，Beert J，et al.Linear viral load increase of a single HPV-type in women with multiple HPV infections predicts progression to cervical cancer [J].Int J Cancer，2016，139（9）：2021-2032.

[7] Arbyn M，Snijders PJ，Meijer CJ，et al.Which high-risk HPV assays fulfil criteria for use in primary cervical cancerscreening？[J].Clin Microbiol Infect，2015，21（9）：817-826.

[8] 楊光華.病理學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013：312-313.

[9] Al-Shabanh OA，Hafez MM，Hassan ZK，et al.Human papillomavirus genotyping and integration in overian cancer saudipatients[J].Virology Journal，2013，10（10）：343.

[10] 馮瑞梅，陳汶，喬友林.高危型人乳頭瘤病毒核酸體外檢測試劑盒臨床功能驗證的中美指導原則解讀[J].中華腫瘤雜志，2017，39（7）：553-557.

[11] 田亞賓，張春濤.人乳頭狀瘤病毒核酸分型檢測試劑的研究進展[J].中國腫瘤雜志，2018，40（10）：729-735.

[12] 趙雪蓮，熱米拉·熱扎克，胡尚英，等.高危型HPV DNA單獨檢測及與薄層液基細胞聯合篩查宮頸癌及宮頸高度病變的篩查效果比較[J].中華預防醫學雜志，2018， 52（5）：469-473.

[13] Wright TC，Stoler MH，Behrens CM，et al.Primary cervical cancer screening with human papillomavirus：end of study results from the A-THENA study using HPV as the first-line screening test[J]. Obstet Gynecol，2015，136（2）：189-197.

[14] Waxman AG，Chelmow D，Darragh TM，et al.Revised terminology for cervical histopathology and its implications for management of high-grade squamous intraepithelial lesion of the cervix[J].Obstet Gynecol，2012，120（6）：1465-1471.

[15] Ou D，Garberis I，Adam J，et al.Prognostic value of tissue necrosis，hypoxia-related markers and correlation with HPV status in head and neck cancer patients treated with bio- or chemo-radiotherapy[J]. Radiother Oncol，2018， 126 （1）：116-124.

[16] Tomaic V.Functional roles of E6 and E7 oncoproteins in HPV-induced malignancies at diverse anatomical sites[J].Cancers（Basel），2016，8（10）：E95.

[17] Shi W J，Liu H，Wu D，et al. E6/E7 proteins are potential markers for the screening and diagnosis of cervical pre-cancerous lesions and cervical cancer in a Chinese population[J]. Oncol Lett，2017，14（5）：6251-6258.

[18] Carow K，Read C，H？覿fner N，et al. A comparative study of digital PCR and real-time qPCR for the detection and quantification of HPV mRNA in sentinel lymph nodes of cervical cancer patients[J]. BMC Res Notes，2017，10（1）：532.

[19] Hsu YW，Huang? RL，Su? PH，et al.Genotype-specific methylation of HPV in cervical intraepithelial neoplasia[J]. J Gynecol Oncol，2017，28（4）：e56.

[20] Tao X，Zheng B，Yin F，et al.Polymerase chain reaction human papillomavirus（HPV） detectionand HPV genotyping in invasive cervical cancers with prior negative HC2 test results[J].Am J Clin Pathol，2017，15（3）：477-483.

[21] 李芹，劉春容，李靜，等.世界范圍內9～26歲女性對HPV的認知現狀及預防性HPV疫苗的應用現況[J].中國腫瘤，2017，26（3）：161-169.

（收稿日期：2021-03-06）