電噴霧多級質譜研究功能小分子與蛋白質的非共價相互作用
——推薦一個化學生物學教學實驗

張于錳，陳語嫣，劉艷

廈門大學化學化工學院，福建省化學生物學重點實驗室(廈門大學)，福建 廈門 361005

在功能小分子與蛋白質的非共價相互作用研究方面，酶的抑制劑篩選是重要的應用領域之一，在藥物研發方面具有極其重要的科學意義及社會價值。質譜技術因其高靈敏、快速、高效、樣品消耗量小(pmol-fmol)等特點，在非共價復合物研究方面顯示出巨大的應用潛力，與H/D交換技術相聯合還可以描述蛋白折疊動力學過程[1]。通過“Intensity-Fading”間接的質譜檢測技術也可以有效獲得蛋白質與配體相互作用位點及作用本質信息[2]。

1 質譜技術研究功能小分子與蛋白質相互作用的基本策略

電噴霧電離(Electrospray Ionization，ESI)及基質輔助激光解吸電離(Matrix Assisted Laser Dissociation Ionization，MALDI)是研究功能小分子與蛋白質的非共價相互作用常用的軟電離質譜離子源。

質譜研究功能小分子與蛋白質的非共價相互作用成功的關鍵是保證蛋白質是在“天然”狀態下進行質譜測試。通常可以使用溫和的電壓(例如，錐孔電壓Cone Voltage)、毛細管溫度等儀器測試參數和采取溫和的樣品制備策略，來實現蛋白質在“天然”狀態下的質譜測試。蛋白質、多肽的分子量較大，在質譜中的離子化效率較低。因此，為了提高蛋白質、多肽在質譜中的離子化效率及檢測靈敏度，往往在樣品制備過程中，將蛋白、多肽溶于含0.1% HCOOH或0.1% HOAc并含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。然而，這樣的樣品溶液配制方法對蛋白質非共價復合物的檢測非常不利，強酸環境、有機溶劑的使用，會降低非共價復合物的穩定性，從而導致復合物結構解離。具體來說，pH越低，有機溶劑含量越高，蛋白質與功能小分子的非共價復合物越容易解離[3]。除了蛋白樣品緩沖溶液pH、有機溶劑外，所有能夠導致蛋白質變性的因素都不利于蛋白質非共價復合物的穩定存在。因此，質譜毛細管溫度和工作電壓在研究蛋白質非共價復合物時也是需要考慮優化的重要因素。

肌紅蛋白(Myoglobin)，是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質。當肌肉損傷時，肌紅蛋白就從肌肉組織中漏到循環血液中，使血清肌紅蛋白濃度增加。臨床上常用該指標來判斷是否發生肌肉損傷。由于肌紅蛋白自身就是通過血紅素輔基鐵卟啉與蛋白質的非共價相互作用而形成的蛋白復合物，常常用其來衡量非共價蛋白復合物的質譜測試參數的有效性。

2 實驗設計

功能小分子與蛋白質的相互作用研究最為典型的應用就是酶的抑制劑篩選。基于質譜技術的酶抑制劑篩選方法可分為直接篩選法(圖1A，1B)和間接篩選法(圖1C)[4]。圖1A中，通過直接檢測酶-抑制劑復合物，實現小分子酶抑制劑的直接篩選；圖1B中，先利用質譜“釣”到酶-抑制劑復合物后，通過測試條件的改變，實現復合物的解離，再利用質譜直接檢測、鑒定小分子抑制劑；圖1C中，則以酶底物的酶解產物為“報告分子”，利用質譜檢測“報告分子”間接實現抑制劑的篩選。

圖1 基于質譜技術的酶抑制劑篩選策略[4]

本實驗選擇以肌紅蛋白為模型蛋白，來模擬酶抑制劑的直接篩選方法(圖1B)，通過測試樣品溶液條件的改變，考查pH環境及有機溶劑對肌紅蛋白復合物的電噴霧質譜全掃描譜的差異，讓學生觀察肌紅蛋白的測試條件對其復合物測定的影響。此外，通過待測樣品中酸或有機溶劑的增加，實現復合物的完全解離釋放出小分子配體——血紅素輔基，即鐵卟啉環，計算蛋白復合物與蛋白質的質量差值，確定小分子配體鐵卟啉環輔基的分子離子峰，并對其進行二級質譜解析，以獲得相應的結構信息。

該實驗是在廈門大學化學生物學系早期的“化學生物學綜合實驗”[5]基礎上的進一步拓展。早期教學實驗僅進行了測試樣品溶液條件的改變對復合物質譜測定的影響考查，沒有引入酶抑制直接篩選應用策略的介紹以及二級質譜對小分子配體的定性分析。改進后的實驗更有利于學生利用簡單的模型蛋白復合物，全面理解基于電噴霧多級質譜技術的功能小分子與蛋白質的非共價相互作用研究的實際應用。

選擇肌紅蛋白作為本實驗的研究對象有三個根本設計原因。其一，肌紅蛋白是一種常規的商品化的蛋白質，并且其本身就是蛋白質與血紅素輔基的非共價相互作用復合物，可以有效模擬酶-抑制劑復合物，樣品來源方便，便宜易得，有利于在大學本科基礎實驗教學中推廣使用；其二，以甲醇、醋酸作為蛋白質復合物的變性劑以及互作破壞劑，考查這兩種常用的生物質譜測試輔助試劑對血紅素輔基(抑制劑)與肌紅蛋白(酶)復合物結構的影響，并在線解離血紅素輔基，利用二級質譜分析技術完成血紅素輔基定性分析過程，幫助學生利用簡單的模型更好地體會并了解實驗核心意義；其三，肌紅蛋白是被普遍認可的標準物質，用來評價維系非共價蛋白質復合物“天然”狀態的質譜測試條件的有效性，直接選擇肌紅蛋白進行質譜測試，有利于學生更好地了解其在質譜上的譜學特性。

3 實驗操作

3.1 儀器與試劑

3.1.1 儀器

德國布魯克道爾頓公司AmaZon SL電噴霧離子阱質譜；精密分析天平：賽多利斯精密天平(型號：BT224S，精確讀數0.1 mg)；漩渦混勻器：北京大龍MX-S可調式混勻儀。

3.1.2 試劑

馬心肌紅蛋白(Myoglobin,Mw≈ 17500)購自上海生工，市售的馬心肌紅蛋白本身含有血紅素輔基，或者稱為鐵卟啉輔基，為了便于討論，文中用“肌紅蛋白復合物”表示肌紅蛋白與鐵卟啉輔基之間存在弱相互作用的復合物形式；超純水Milli-Q純化(Millipore，Bedford，MA，USA，18.2 MΩ·cm)；甲醇(HPLC級)，Merck Co.(Darmstadt，德國)；醋酸(MS純)，Sigma Co.。

3.2 實驗步驟

3.2.1 樣品配制

Solution A：稱取1 mg馬心肌紅蛋白于1.5 mL離心管，加入1 mL超純水(此時肌紅蛋白水溶液的pH ≈ 9)，渦旋混勻器中混勻，國產0.22 μm聚醚砜樹脂(PES)針式過濾頭過濾，得到濃度為5.715 ×10-5mol·L-1的馬心肌紅蛋白儲備液。

Solution B1-B5：分別取100 μL Solution A于5個1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，以及400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B6-B10：分別取100 μL Solution A、10 μL 0.1%醋酸水溶液于5個1.5 mL離心管中，再分別加入0、100、200、300、400 μL甲醇，400、300、200、100、0 μL超純水，混勻，備用。

Solution B1-B10的馬心肌紅蛋白的測試終濃度為1.143 × 10-5mol·L-1。

3.2.2 儀器操作

質譜條件設置：

1) 全掃描質譜：正離子模式；用流動注射泵進樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍600-2200m/z；Target mass 1200；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1; average: 5；Rolling Average: 15。

2) MS/MS質譜：正離子模式；用流動注射泵進樣，流速為40 μL·min-1；掃描范圍200-1200m/z；Target mass 616；Dry temperature 220 °C；nebulizer 7 Psi；Dry gas: 4.5 L·min-1；average: 5；Rolling Average: 5。

3.2.3 數據分析

分別對Solution B1-B10待測溶液進行質譜檢測，待總離子流穩定后，保存此時掃描譜圖。利用儀器自帶的數據分析軟件(Compass DataAnalysis)進行數據分析，具體質譜檢測結果如圖2及圖3所示。圖2中，甲醇含量為0時(圖2a)，在上述質譜檢測條件下，既觀察到肌紅蛋白復合物的質譜多電荷信號峰，也檢測到了解離的蛋白質的質譜信號峰，說明該質譜檢測儀器參數還可以進一步優化，以完全消除蛋白復合物的解離。隨著甲醇含量的逐步增加(圖2b和2c)，肌紅蛋白復合物的質譜多電荷信號峰逐漸減弱，蛋白質的質譜信號逐漸增強，說明多數的蛋白以單體形式存在，當甲醇含量達到60%時，復合物基本都發生了解離，以蛋白質單體形式存在，表現出多電荷的近似正態分布峰型(圖2d)，復合物自身的多電荷峰極弱(對應圖2d中，帶15個電荷的分子離子峰1172.21m/z)。當甲醇濃度達到80%時(圖2e)，蛋白質復合物離子化效率大大降低，蛋白質單體多電荷峰不顯著。

圖2 不同甲醇比例下肌紅蛋白與其鐵卟啉環輔基弱相互作用電噴霧質譜圖

另外，加入醋酸的組別(圖3)與不加醋酸的組別(圖2)相比，特別是圖3e與圖2e相比較，同樣是在80%的甲醇溶液中，酸的引入可以大大提升蛋白質的離子化效率，表現出良好的質譜檢測信號峰(圖3e)。這也說明了在蛋白質、多肽的質譜檢測過程中，加有機酸提高其離子化效率的重要性。另外，10 μL 0.1%醋酸的使用，甲醇含量為0時(圖3a)，完整的肌紅蛋白復合物以及解離蛋白質可以同時檢測到，當甲醇含量提高到40%時，鐵卟啉環輔基與肌紅蛋白仍保持較為強烈的相互作用，除了部分解離的蛋白質外，復合物的多電荷峰也可以顯著地檢測到，在質譜圖上呈現較為良好的近似正態分布的多電荷峰型(圖3c)。但是，當甲醇含量提高到60%時，肌紅蛋白復合物完全解離，釋放出鐵卟啉環輔基，在質譜設定的掃描范圍中呈現出蛋白質的近似正態分布的多電荷峰型(圖3d)。

圖3 10 μL 0.1%醋酸環境不同甲醇比例肌紅蛋白與其鐵卟啉環輔基弱相互作用電噴霧質譜圖

利用Compass DataAnalysis軟件中Deconvolution功能，對譜圖進行去卷積分析，可以獲得質譜圖2、圖3上蛋白質峰所帶電荷數的指認。通過多電荷峰的質荷比，以及相應的電荷數，可以推算出原蛋白質的分子量。以圖3b為例，經去卷積計算分析，圖中肌紅蛋白復合物平均分子量為17570.00 Da，鐵卟啉輔基解離后的肌紅蛋白平均分子量為16954.73 Da，兩者之間分子量相差615.27 Da，該丟失的分子量可能對應肌紅蛋白復合物解離下來的相互作用的功能小分子鐵卟啉環輔基。

為探究該中性丟失小分子的結構特征，對質譜信號強且肌紅蛋白復合物完全解離的圖3e樣品進行二次測試，調節質譜測試的掃描范圍為200-1200m/z，在該質譜掃描范圍內，尋找[615 + H]+峰，即616m/z質譜信號峰。研究結果表明，圖3e樣品在掃描范圍200-1200m/z中，確實檢測到極強的616m/z質譜信號峰，對該分子離子峰進行二級質譜碎裂分析，結果如圖4所示。

圖4 分子量616.27捕獲的二級碎裂電噴霧質譜峰

從圖4中可以觀察到，所捕獲的分子離子峰616.27m/z，經二級質譜碰撞誘導解離(Collision-Induced Dissociation，CID)后，最典型的碎裂特征是：中性丟失59 Da，產生碎片峰557.28m/z。中性丟失59 Da，可以通過C―C鍵的均裂，以乙酸自由基形式(·CH2COOH)離去而實現，因此，分析輔基結構中可能含有乙酸基團，與鐵卟啉環輔基結構特征一致(圖5)。

圖5 鐵卟啉環輔基結構式

4 結語

質譜測試之前的樣品前處理是質譜測試結果好壞的關鍵。學生在大學四年級之前的儀器分析等理論課上對質譜分析的基本原理等都有所了解，但是質譜測試前的樣品前期準備的相關知識缺少培訓。另外，廈門大學化學化工學院“化學生物學綜合實驗”安排在大四秋季學期，學生正好都處于進入實驗室進行本科畢業論文設計實踐階段，有利用質譜分析樣品的潛在需求。因此，在做實驗之前，結合PPT將背景知識以及常規質譜配樣、上機操作的基本注意事項對學生進行詳細講解。引導學生掌握基本的質譜分析、樣品制備的基本常識(如質譜正負離子檢測模式選擇的依據、二級質譜的測試意義、樣品脫鹽處理的基本方法、質譜圖軟件分析方法等)。引導學生觀察、思考不同樣品測試條件下，肌紅蛋白復合物在電噴霧質譜全掃描中的表現形式的差異形式是什么，差異產生原因是什么。蛋白樣品的稱量由助教完成。所有蛋白樣品溶液的配制由學生現場完成，現用現配。建議分組進行教學實驗，1組安排5-6名同學。每次實驗安排1組同學，可以統一配制一組Solution B1-10的待測樣品，小班教學實驗過程中可以保證每位同學都可以獨立進行實際的上機操作。整個實驗時長約3-4小時(包括PPT講解時間)。

最后，需要說明的是，本教學實驗提供了一種利用簡單的蛋白質復合物模型來模擬酶抑制劑直接篩選過程的策略，適合于沒有現成“目標酶及潛在抑制劑”篩選體系的學校開展相關教學工作。如果原有教學平臺已具有“目標酶及潛在抑制劑”的篩選體系，可以將該質譜實驗的設計原理直接用于自身的篩選體系。另外，為了讓學生在一次樣品測試中能同時觀察到肌紅蛋白復合物和解離的蛋白質的多電荷質譜信號峰，以及兩組多電荷質譜峰的變化趨勢，不必讓學生過于刻意地、耗時地現場優化出只有蛋白復合物而沒有解離峰的質譜測試條件。此外，由于卟啉環結構穩定，在CID二級質譜碎裂模式下不容易碎裂，因此在探究其結構的過程中，我們僅僅進行了二級質譜裂解。對于其他實際樣品而言，若其小分子配體結構在CID模式下容易解離為分子量不同的各種碎片離子，則可以進一步對其進行三級及以上的多級分析，對每一級碎裂下來的碎片峰進行多級分析可以更好地獲知并了解該配體更為詳盡的結構信息，這也是多級質譜在研究化合物結構特征的優勢和獨特作用。