Molisch反應：發現、原理及應用

郝志友，陳輝，曹彥剛，孫彥君，李紅偉，鄭曉珂，馮衛生

河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046

Molisch反應由Hans Molisch發現，又叫α-萘酚-濃硫酸反應、莫立許反應等，是一個重要的鑒別糖和苷類化合物的化學反應。由于其反應簡便、靈敏的優點，在糖和苷類研究歷史中起到了極大的作用。然而，也許是囿于篇幅限制，在生物化學、藥物化學、中藥化學、天然藥物化學、食品化學等相關專業課程的教材中，只是對Molisch反應原理做粗略介紹，甚至不做介紹，更遑論其發現過程及其拓展應用。本文根據原始文獻，對Hans Molisch的學術經歷，Molisch反應的發現、原理及應用進行回顧，供相關教師在課堂上參考應用，以提高相關專業大學生對該知識點的學習興趣，拓展其知識范圍，并期望今后該反應在糖的定量研究上起到更大的作用。

1 Hans Molisch簡介

漢斯·莫立許(Hans Molisch，1856-1937)[1,2]生于捷克布隆(Brünn，今捷克布爾諾)，是一位苗圃主人的兒子，兒時幫助他的父親進行苗圃種植工作，為他成為一個著名的植物生理學家培養了濃厚的興趣。1897年，他開啟了他的熱帶植物學之旅，并在印度尼西亞茂物進行了一段時間的植物生理學研究，后經由中國、日本、美國返回捷克布拉格。1909年，被任命為維也納大學植物生理學系主任，直到1928年，退休后他被任命為名譽教授。在此期間，他接到邀請，擔任日本東北大學新成立的生物研究所的負責人三年，隨后他到加爾各答玻色研究所(Bose Institute)講課和工作，這些均廣泛地擴展了他的研究領域。

Molisch研究領域非常廣泛，除在植物生理學研究領域著述頗豐外，還在植物生物學、生物化學、植物微化學等方面頗有建樹。他分離得到許多種類的紫色光合細菌，包括莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)，促進了他細菌光合作用的研究發現。他對植物學和化學的出色研究使他能夠將兩門學科結合，而提出了植物化感作用(allelopathy)的概念，他是植物化感作用研究的開拓者，現在已發展成為獨立學科。

2 Molisch反應的發現

人們很早就認識到，糖類物質深度參與了植物的生理、生化過程，是一類及其重要的化合物。因此，就需要研究者用較敏銳的方法檢識微量糖類物質是否存在。在Molisch的時代，糖類物質的鑒定反應包括Trommer反應[3]、Fehling反應[3]等。然而，這些反應的靈敏度不高、專屬性不強，因此鑒定糖類化合物的準確度差。

1886年，Molisch在對植物生理學的研究過程中，偶然發現了一種非常靈敏的檢測糖或者苷是否存在的反應[4]。在試管中，將約0.5-1 mL的待測溶液滴入兩滴15%-20%的α-萘酚的乙醇溶液，搖勻，隨后倒入兩倍體積的濃硫酸并迅速振搖，此時如果待測溶液中有糖的存在，則溶液迅速呈現紫色。隨后用水稀釋可使紫色物質沉淀，該沉淀物可溶于氫氧化鉀溶液、乙醇、乙醚和氨水中。Molisch發現該反應不針對特定類型的糖，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖均發生了顯色反應。多元醇類物質，包括肌醇、甘露醇、衛矛醇和櫟醇則不發生顯色反應。

Molisch發現，不僅對糖類化合物可以發生上述反應，對于糖苷類化合物，以上反應也可以立即或在很短的時間內發生。因此，如果在上述條件下用任何液體獲得了紫色物質，則應推斷以上待測溶液中含糖，或糖苷類化合物在濃硫酸作用下反應生成了糖。

Molisch測試了許多其他類型的有機物，包括酒精、有機酸、脂肪、苯烴、酚類、樹脂、生物堿、蛋白質等，均對此反應呈陰性。因此該方法對檢出糖和苷的存在具有很好的排他性。

該反應靈敏度極高，無需加熱即可輕松檢測到0.00001%的糖，靈敏度遠超Trommer和Fehling試驗。

此外，當時的人們已經認識到，糖(葡萄糖)是健康人尿液的組成成分，糖尿病人尿液中糖的含量遠超正常狀態，而其時檢測尿液中糖含量是否偏離正常狀態的檢測方法不夠靈敏。Molisch天才的想法解決了該問題。其將正常尿液和待測尿液用水稀釋至其體積的100倍，均用上述方法反應，如果待測尿液反應后出現的紫色要比正常尿液深的多，則視其為糖尿病尿。或者，將正常尿液和待測尿液稀釋至其體積的400-600倍，如果是糖尿病人的尿液，即使稀釋到如此大的程度，仍能明顯地產生以上反應現象，而正常尿液則無明顯顯色。以上半定量的方法為當時人們診斷糖尿病提供了很好的工具。

從此以后，該反應被廣為人知，在植物、動物、真菌中糖或苷類化合物的定性鑒別中被廣泛應用[5]，并根據它的發明者命名，被稱作莫立許反應(Molisch’s Reaction，Molisch’s Test)。隨著該反應的廣泛應用，人們對該反應過程進行了改進，現在一般反應方法如下：待測溶液約1-2 mL加入試管，滴入2-3滴5%的α-萘酚乙醇溶液，搖勻，沿試管壁緩慢加入1-2 mL濃硫酸，勿振搖。因濃硫酸較重，因此沉入試管底，上層為待測液。如果待測溶液中含有糖或苷類化合物，則在濃硫酸層和待測液層的交界處，會產生一個紫色的環，因此該反應也稱“紫環反應”(反應流程如圖1)。

圖1 Molisch反應操作流程示意圖

3 Molisch反應的原理

Bredereck研究了Molisch反應的原理[6,7]，認為單糖首先在濃硫酸作用下脫水縮合生成5-羥甲基糠醛(由己糖生成)或糠醛(由戊糖生成)，又在濃硫酸作用下，和兩分子α-萘酚縮合生成了化合物1，化合物1迅速在濃硫酸作用下，氧化生成化合物2和3而顯色。反應過程如圖2。

圖2 Bredereck的Molisch反應原理

但Mutsuko Ohta等[8]對以上推測的結果表示懷疑，他們認為沒有直接的證據表明這些結構的存在。由于磺化產物的形成，對Molisch反應產物在結晶狀態分離幾乎不可能。在濃硫酸存在下，α-萘酚極易在C-2位(然后在C-4位)磺化?；腔磻狗磻a物從反應體系中分離，或者反應產物的結晶，都變得困難。因此使用衍生化物反應會改善這種情況。Mutsuko Ohta等發現，用2-甲基-α-萘酚代替α-萘酚和己糖、戊糖反應一樣靈敏，且其有色反應產物易于結晶，因此可用以推測Molisch反應的機理。其用葡萄糖或5-羥甲基糠醛和2-甲基-α-萘酚、濃硫酸反應后，反應體系用乙酸乙酯萃取，萃取物用硅膠柱色譜分離，均得到化合物4；用鼠李糖或5-甲基糠醛與2-甲基-α-萘酚、濃硫酸反應后，反應體系用乙酸乙酯萃取后，用硅膠柱色譜分離，均得到化合物5。將4、5的紫外光譜和反應混合液的紫外光譜對比，發現反應混合液和產物的紫外光譜最大吸收所在波長相同，因此推測這兩個化合物是反應體系特征性顯色的原因。反應過程如圖3所示。

圖3 Mutsuko Ohta等的Molisch反應原理

從以上實驗過程可以看出，該方法的缺點是只考慮到了反應產物的乙酸乙酯萃取物，而未考慮反應體系中的水溶性成分。因此，隨著混合物分離技術及波譜解析技術的進步，Molisch反應機理仍值得進一步研究驗證。

4 Molisch反應的應用

毋庸置疑，自從Molisch發現該反應后，由于其敏銳的反應特點，很快廣泛應用于各種有關糖和苷的定性研究中。雖然Molisch反應發現時就進行過半定量的實驗，以區別正常尿液和糖尿病尿[4]，但很長時間以來其定量分析的功能被忽略了。然而，經過對實驗的改進，確有部分研究者將此反應用在糖類物質定量分析的嘗試上。

Devor A. W.[9,10]對Molisch反應進行改進，以使其更適合于進行糖的比色定量分析。在正常的Molisch反應中，也包含了α-萘酚和濃硫酸的反應，因此Molisch反應的有色縮合物中除了包含糠醛衍生物外，還包含一系列的α-萘酚磺化物，這些磺化物的紫外吸收可能干擾比色結果。因此，Devor A. W.用預先磺化的α-萘酚代替正常Molisch反應中的α-萘酚，進行反應后比色測定，以消除Molisch反應過程中試劑濃度、溫度、加熱時間等的干擾，獲得更具重復性的結果。Troelsen J. E.[11]用類似的方法測定羊的飼料和糞便中葡萄糖和木糖含量，確定了飼料的可消化性。

張志華等[12]將一定量的葡萄糖溶液和濃硫酸混勻，70 °C水浴反應15 min (產生糠醛衍生物)，放至室溫后加一定量的α-萘酚，搖勻放置10 min (產生有色物質)，加無水乙醇稀釋至10 mL，稀釋至不同濃度，在570 nm處測定吸光度，繪制工作標準曲線，表明在葡萄糖濃度在在1-50 × 10-6g·mL-1之間線性關系良好，可以用于含量測定，并測定了木糖醇中還原糖的含量。李勇等[13]的發明專利公開文件中也介紹了一種用類似方法測定木糖醇中還原糖的方法。洪陵成[14]的發明專利公開文件中，介紹了一種水中糖含量的比色檢測方法，也是用Molish反應后比色的方法進行。楊同香等[15]用Molisch反應后比色的方法建立了一種測定糖廠汽凝水蔗糖含量的方法。李繼民等[16]建立了α-萘酚-濃硫酸分光光度法快速測定不同廠家復印紙水解液中還原糖含量的方法，為基層民警提供了快速、經濟、簡便的紙張物證的鑒定方法。

鄭敏燕等[17]建立了一種以葡萄糖為標準對照品，通過α-萘酚-硫酸顯色、吸光光度法測定多糖含量的方法，用于測定白果多糖的含量。結果顯示，溶液最大吸收波長569 nm，標準葡萄糖溶液在0.57-11.5 μg·mL-1范圍內與吸光度之間具有良好的線性關系，與苯酚-硫酸法相比較，測量結果基本一致。張世仙等[18]用類似方法測定酒糟多糖的含量，顯示在6-36 μg·mL-1范圍內吸光度與被測物含量呈良好的線性關系，重復性好，結果可靠。

5 結語

Molisch反應發現一百多年來，在相關領域有關糖和苷類化合物的定性研究中起到不可磨滅的作用。其反應機理研究由于年代較早，在很大程度上屬于反應過程的推測，因此值得更進一步厘清，且進一步反應機理的研究需同時考慮反應體系中的脂溶性和水溶性反應產物。此外，以往該反應較少用在糖或苷類物質的定量分析上，但根據已有的文獻，該反應在定量分析上極有前景，因此相關研究者值得在這方面給予更多關注。