10個(gè)玉米ZmbZIP基因表達(dá)模式分析

賈利強(qiáng)，吳洪梅，曾科美，龍金云，鄭 飛，趙秋芳，陳 曙

（1. 貴州師范學(xué)院, 貴州 貴陽 550018；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 廣東 湛江 524091）

0 引言

【研究意義】玉米作為重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作用，在保障糧食安全和種植者創(chuàng)收增效中發(fā)揮著重要作用。玉米生長周期內(nèi)，經(jīng)常遭受各種逆境脅迫因子的侵害，致使產(chǎn)量下降，經(jīng)濟(jì)收入遭受損失，培養(yǎng)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)抗逆性好的玉米新品種至關(guān)重要。bZIP蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子中種類最多、分布最廣的調(diào)控因子之一，其功能在越來越多的作物中進(jìn)行研究，bZIP廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程及逆境脅迫響應(yīng)途徑。

基于此，以玉米自交系鄭58為試驗(yàn)材料，人為模擬鹽、干旱、低溫和氮缺乏脅迫，系統(tǒng)研究bZIP基因的表達(dá)模式，可以為深入挖掘這些基因的功能提供有價(jià)值的科學(xué)數(shù)據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物中，包括酵母、動(dòng)植物等，并在其生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征是含有bZIP結(jié)構(gòu)域，包含N端保守的堿性蛋白基序和C端保守的亮氨酸拉鏈基序，前者功能為核定位信號(hào)和靶基因的標(biāo)定，而后者的功能為二聚體化，激活下游基因的表達(dá)[1]。隨著基因組測序計(jì)劃的開展，越來越多的植物bZIP基因家族成員被報(bào)道出來。 擬南芥[2]編碼78個(gè)，葡萄[3]有55個(gè)，大棗[4]有45個(gè)，禾本科作物水稻[5]、玉米[6]、高粱[7]和蕎麥[8]分別有89個(gè)、125個(gè)、92個(gè)和96個(gè)，油料作物油菜[9]、大豆[10]和芝麻[11]各含有247個(gè)、131個(gè)和63個(gè)，茄科作物番茄[12]、馬鈴薯[13]和辣椒[14]分別有69個(gè)、80個(gè)和60個(gè)。根據(jù)序列相似性、保守蛋白基序和蛋白結(jié)構(gòu)等差異，擬南芥bZIP蛋白可以劃分為10個(gè)家族[1]，而在水稻中，可以劃分為11個(gè)亞家族[5]。bZIP基因廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程及逆境脅迫響應(yīng)途徑[15]，諸如生物或非生物脅迫、種子萌發(fā)，開花和種子發(fā)育、激素和糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[16-18]。FD蛋白，bZIP家族成員之一，調(diào)控植物開花[19]，而另一個(gè)成員，HY5蛋白抑制莖的伸長和側(cè)根發(fā)育[20]。越來越多的研究表明bZIP基因在植物抵御逆境脅迫進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用，包括水分脅迫[21]、鹽毒害[22]、溫度脅迫[23]、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23-25]、病蟲害[26-27]等。擬南芥AtbZIP1、AtABF3、AtbZIP24等基因參與調(diào)控?cái)M南芥應(yīng)答溫度脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫[28-29]。水稻中的OsbZIP23、OsbZIP71和OsbZIP52也參與調(diào)控各類逆境脅迫響應(yīng)途徑，超表達(dá)OsbZIP23和OsbZIP71能顯著提高水稻的抗旱和抗鹽性能[3]，而OsbZIP52則負(fù)調(diào)控水稻抵御抗旱和抗冷性能[28]。大豆GmbZIP1、GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78也參與調(diào)控各類逆境脅迫響應(yīng)途徑，超表達(dá)這些基因會(huì)提高大豆的抗逆性能[30-31]。擬南芥bZIP亞家族A、D、H和S等成員廣泛參與調(diào)控N吸收效率，其中AtbZIP1是傳遞N信號(hào)途徑的主要調(diào)控因子[32]，AtHY5和AtHYH等基因調(diào)控硝態(tài)氮、銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體以及硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性[20,33]，小麥TabZIP60負(fù)調(diào)控氮素吸收和小麥產(chǎn)量[34]。【本研究切入點(diǎn)】玉米自交系鄭58作為我國重要的骨干核心種質(zhì)資源，在各類逆境脅迫處理下，包括高鹽、干旱、低溫和硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫下，ZmbZIP響應(yīng)表達(dá)模式還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文利用人為模擬各類逆境脅迫，設(shè)置200 mmol·L-1的NaCl溶液、20%PEG6000、4 ℃低溫和硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫試驗(yàn)，選取10個(gè)ZmbZIP基因，探測這些基因的應(yīng)答表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步深入研究玉米bZIP基因生物學(xué)功能提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用到的試驗(yàn)材料為玉米核心自交系鄭58，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究中心。玉米自交系鄭58授粉揚(yáng)花期，采集根、莖、葉、花和授粉15 d的嫩穗，快速液氮處理，以備后用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米ZmbZIP的生物信息學(xué)分析 本文研究中所涉及的基因、蛋白和CDS序列來自于Phytozome v9.1數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/）、MaizeGDB（Maize Genetics and Genomics Database）數(shù) 據(jù) 庫（http://www.maizedb.org/）和TAIR （https://www.arabi dopsis.org/）。利用在線軟件ExPasy來分析玉米ZmbZIP蛋白的分子量大小和理論等電點(diǎn)（http://web.exp asy.org/cgi-bin/prot-param/protparam）。依據(jù)ZmbZIP基因的物理位置，利用Mapinspect繪制其在染色體上的分布（http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-ma pinspect.html）。根據(jù)ZmbZIP基因和CDS序列，利用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）來分析ZmbZIP基因結(jié)構(gòu)。本文中有10個(gè)ZmbZIPs和78個(gè)AtbZIPs蛋白序列構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣，利用在線軟件MAFFT進(jìn)行多重比對分析，剔除非保守蛋白序列，構(gòu)成保守的bZIP蛋白序列數(shù)據(jù)矩陣，用于進(jìn)化樹分析。利用MEGA X軟件中的NJ算法來分析bZIP蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，缺失數(shù)據(jù)參數(shù)選Pairwise Deletion，模型為P-distance，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.2.2 非生物脅迫試驗(yàn) 鄭58自交系種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液表面消毒，28 ℃黑暗催芽，生長于Holland營養(yǎng)液中，生長條件為28 ℃光照16 h，25 ℃黑暗8 h，生長至3葉1心期，進(jìn)行非生物脅迫試驗(yàn)。低溫脅迫試驗(yàn)是將幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，模擬干旱或鹽脅迫處理是利用20% PEG6000或200 mmol·L-1的NaCl溶液對幼苗進(jìn)行脅迫處理[35]，缺氮脅迫試驗(yàn)，將正常生長的玉米幼苗（NH4NO3為氮素來源，總氮濃度為2 mmol·L-1）轉(zhuǎn)移至銨態(tài)氮或硝態(tài)氮缺乏（用KNO3或NH4Cl替換NH4NO3）的營養(yǎng)液中進(jìn)行脅迫處理，總氮濃度保持在2 mmol·L-1水平。在脅迫處理的0、1、6、24 h后，收集對照植株（0 h）和處理植株的第2片葉用于實(shí)時(shí)定量PCR分析。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)取5株幼苗。

1.2.3 RNA提取及定量PCR分析 利用華越洋植物RNA快速提取試劑盒提取各樣品的總RNA，檢測其濃度和純度后（NanoDrop ND-2000），按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化（Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）。反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋至質(zhì)量濃度為100 μg·μL-1作為擴(kuò)增模板。根據(jù)目的基因序列的保守性，利用Oligo 7設(shè)計(jì)特異性引物（表1），Actin作為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)定量PCR分析利用Roche Light Cycler 480 System（Roche，Basel，Switzerland）定量檢測系統(tǒng)，反應(yīng)系統(tǒng)10 μL，包括 SYBR Premix EXTaqTMkit 5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性 5 s，55 ℃退火 5 s， 72 ℃延伸25 s，45個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△CT算法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。對于脅迫處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，將各處理0 h各基因表達(dá)量設(shè)定為1，并以此來計(jì)算其他時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量，并使用 （平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）來表示。

表1 ZmbZIP基因表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis on ZmbZIPs

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP生物信息學(xué)分析

為了研究玉米bZIP基因的表達(dá)信息，我們選取了10個(gè)ZmbZIP基因作為本文的研究對象，其基本信息見表2。10個(gè)ZmbZIP蛋白長度從121 aa（ZmbZIP101）～246 aa（ZmbZIP3），相應(yīng)的分子量從13.41 kDa～26.83 kDa。大部分ZmbZIP蛋白的理論等電點(diǎn)呈中性或堿性，除了ZmbZIP3（PI=5.53）和ZmbZIP101（PI=4.77）（表2）。10個(gè)ZmbZIP基因散布于8個(gè)染色體上，其中Chr1和Chr3染色體上分別有2個(gè)基因，Chr2、Chr4、Chr5、Chr6、Chr7和Chr9上分別各有一個(gè)ZmbZIP（圖1A）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示10個(gè)ZmbZIP基因的內(nèi)含子數(shù)目變化豐富，三個(gè)基因（ZmbZIP3、ZmbZIP41和ZmbZIP52）沒有內(nèi)含子，其他基因各含有3～12個(gè)內(nèi)含子不等（圖1 B）。10個(gè)ZmbZIP蛋白N端含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域，包括保守的堿性蛋白序列和亮氨酸拉鏈區(qū) （圖1 C）。這10個(gè)ZmbZIP基因在該家族進(jìn)化樹上的位置特殊，可歸為一大類（圖1 D）。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示10個(gè)ZmbZIP蛋白分屬于不同的5個(gè)蛋白家族，顯示10個(gè)ZmbZIP蛋白家族起源于不同的祖先蛋白，并沿著各自的進(jìn)化途徑進(jìn)化而來（圖1-D）。

表2 10個(gè)玉米bZIP基因基本信息Table 2 Basic information on 10 bZIP genes of Z. mays

圖1 10個(gè)ZmbZIPs的生物信息學(xué)分析Fig. 1 Bioinformatics of 10 ZmbZIPs

2.2 ZmbZIP組織特異性表達(dá)模式分析

為了明確ZmbZIP在玉米不同組織中的表達(dá)特異性，利用qPCR技術(shù)，在玉米授粉揚(yáng)花期，檢測了10個(gè)ZmbZIP基因在玉米根、莖、葉、雄花和嫩穗中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示10個(gè)ZmbZIP基因在玉米組織中的表達(dá)模式不同，7個(gè)ZmbZIP基因（ZmbZIP3、ZmbZIP8、27、41、52、101和ZmbZIP132）主要在玉米根系中表達(dá)，是其他組織器官的2倍以上，表明這些基因在玉米的根系生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。ZmbZIP68呈組成型表達(dá)模式，ZmbZIP85主要在玉米根系和嫩穗中表達(dá)，而ZmbZIP74主要在雄花中表達(dá)，高于其他組織器官5倍以上（圖2）。ZmbZIP基因表達(dá)模式分析顯示該家族基因在玉米生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。

圖2 ZmbZIP基因在玉米不同器官中的表達(dá)模式分析Fig. 2 Expressions of ZmbZIPs in different maize tissues

2.3 葉片中ZmbZIP對鹽、干旱或低溫脅迫的響應(yīng)

非生物脅迫諸如干旱、高鹽和低溫脅迫會(huì)對作物葉片造成明顯影響[36]，因此，本文重點(diǎn)分析了玉米葉片中10個(gè)ZmbZIPs應(yīng)答3種脅迫時(shí)的表達(dá)模式。由圖3可知，10個(gè)ZmbZIP基因在應(yīng)對不同逆境脅迫時(shí)的響應(yīng)表達(dá)模式不同。在三種逆境脅迫1 h和6 h時(shí)，ZmbZIP74和ZmbZIP101的表達(dá)量分別上升了2倍以上，表明這2個(gè)基因可能同時(shí)參與3種逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制。ZmbZIP3和ZmbZIP68的表達(dá)至少受2種逆境脅迫的誘導(dǎo)（＞2倍），在NaCl脅迫24 h和低溫脅迫1 h時(shí)，ZmbZIP3表達(dá)量分別上調(diào)了4倍和21倍，ZmbZIP68表達(dá)量分別上升了至少2倍，表明這2個(gè)基因在這2種逆境脅迫中發(fā)揮著作用。ZmbZIP52、ZmbZIP85和ZmbZIP132受到NaCl脅迫的明顯誘導(dǎo)，在脅迫處理24 h時(shí)，其表達(dá)量分別上升了4倍、2.3倍和6倍，而在PEG6000和低溫脅迫時(shí)，這3個(gè)基因多數(shù)受到明顯的抑制，比如在脅迫處理3 h時(shí)，ZmbZIP85的表達(dá)量分別下降了78%和60%，這些數(shù)據(jù)表明10個(gè)ZmbZIP基因在應(yīng)對不同逆境脅迫時(shí)呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，預(yù)示著這些基因可能在玉米抵御不同逆境脅迫時(shí)發(fā)揮多樣的功能。

圖3 玉米葉片中ZmbZIPs應(yīng)答不同脅迫時(shí)的表達(dá)模式分析Fig. 3 Expression patterns of ZmbZIPs under stresses

2.4 ZmbZIP基因?qū)Φ狈γ{迫的響應(yīng)

由圖4可知，葉片中ZmbZIP基因的表達(dá)模式在不同氮元素缺乏脅迫中變化比較大。一類是硝態(tài)氮缺乏脅迫對ZmbZIP基因的影響和銨態(tài)氮缺乏脅迫不同，這類包括基因有ZmbZIP3、ZmbZIP8、ZmbZIP27、ZmbZIP74、ZmbZIP85、ZmbZIP101和ZmbZIP132，這些基因中，銨態(tài)氮缺乏脅迫誘導(dǎo)ZmbZIP基因的表達(dá)，而硝態(tài)氮缺乏脅迫則抑制ZmbZIP基因的表達(dá)，比如ZmbZIP132在脅迫處理1 h時(shí)，硝態(tài)氮缺乏脅迫使該基因的表達(dá)下降了64%，而銨態(tài)氮缺乏脅迫則使該基因的表達(dá)上升了8倍，表明這些基因在響應(yīng)硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫時(shí)的作用機(jī)制有差異。另一類是這2種脅迫處理對ZmbZIP基因的表達(dá)影響相似，如ZmbZIP68，該基因的表達(dá)同時(shí)受2類脅迫處理的抑制，表明該基因可能在應(yīng)對這2類脅迫時(shí)起著類似的作用。

圖4 玉米葉片中的ZmbZIPs應(yīng)答硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的響應(yīng)表達(dá)模式Fig. 4 ZmbZIP expression patterns in maize leaves in response to nitrate or ammonium deficiency

由圖5可知，玉米根系中ZmbZIP基因的表達(dá)模式受不同氮形態(tài)缺乏脅迫調(diào)控。ZmbZIP27、ZmbZIP41和ZmbZIP68同時(shí)受硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫的抑制，尤其ZmbZIP41受硝態(tài)氮缺乏脅迫的嚴(yán)重抑制，脅迫處理1 h時(shí)，其表達(dá)量比處理前下降超過99%，銨態(tài)氮缺乏脅迫使其表達(dá)量下降超過80%，表明這2個(gè)基因在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中發(fā)揮著類似作用。ZmbZIP3表達(dá)的變化趨勢在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中類似，都是先升后降，在脅迫處理1 h時(shí)，達(dá)到最大值，之后慢慢下降。ZmbZIP8、ZmbZIP74、ZmbZIP85和ZmbZIP132的表達(dá)模式在不同氮形態(tài)脅迫中趨勢相反，其中ZmbZIP8和ZmbZIP85受硝態(tài)氮缺乏脅迫的誘導(dǎo)而受銨態(tài)氮缺乏脅迫的抑制，而ZmbZIP74和ZmbZIP132則受銨態(tài)氮缺乏脅迫的誘導(dǎo)而受硝態(tài)氮缺乏脅迫的抑制。ZmbZIP基因在硝態(tài)氮和銨態(tài)氮缺乏脅迫中的不同表達(dá)模式預(yù)示著該基因在玉米應(yīng)對氮缺乏脅迫中的不同作用。

圖5 玉米根系中的ZmbZIPs在硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫時(shí)的表達(dá)模式分析Fig. 5 ZmbZIP expression patterns in maize roots in response to nitrate or ammonium deficiency

3 討論與結(jié)論

作為糧經(jīng)飼三元糧食作物，玉米在保障全球及我國糧食安全方面發(fā)揮著重要作用。然而在其生長周期內(nèi)，經(jīng)常遭受各類逆境脅迫，造成產(chǎn)量減產(chǎn)，使種植者遭受經(jīng)濟(jì)損失。所以挖掘控制逆境脅迫的遺傳因子，解析其調(diào)控的分子生理機(jī)理，對于培育抗逆性好、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的玉米新品種顯得意義重大。bZIP蛋白成員廣泛分布于植物基因組中，在調(diào)控作物抗逆性方面發(fā)揮著重要作用。本文中，逆境脅迫廣泛的調(diào)控bZIP基因的表達(dá)，這與前人的研究類似。不同逆境脅迫對ZmbZIP85基因影響因玉米種質(zhì)的不同而各異，比如，玉米自交系Han21脅迫處理時(shí)，該基因的表達(dá)沒有發(fā)生明顯改變，而在自交系Ye478中，在嚴(yán)重脅迫時(shí)該基因的表達(dá)明顯上調(diào)[6]。擬南芥中ZmbZIP85的同源基因AtbZIP1是逆境脅迫的正調(diào)控因子，提高該基因的表達(dá)能顯著的增強(qiáng)擬南芥的抗逆性[6]。而在本研究中，該基因應(yīng)答鹽、干旱和低溫脅迫時(shí)，表達(dá)模式各異，200 mmol·L-1的NaCl溶液顯著提高該基因的表達(dá)，而20% PEG6000或4 ℃低溫脅迫明顯抑制該基因的表達(dá)，反映了該基因在不同玉米種質(zhì)中應(yīng)答不同逆境脅迫時(shí)的不同調(diào)控機(jī)制。類似的結(jié)果在其他研究中也有報(bào)道，以玉米Yu882為試驗(yàn)材料，ZmbZIP8、ZmbZIP41、ZmbZIP52、ZmbZIP68和ZmbZIP85明顯受到鹽脅迫的誘導(dǎo)[37]，而在我們的試驗(yàn)中，ZmbZIP8受到鹽脅迫抑制，反映了該基因在不同種質(zhì)中的生物學(xué)功能差異。

植物根系依靠硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體或銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體來吸收土壤中的氮素，在這一過程中，大量轉(zhuǎn)錄因子成員參與調(diào)控氮素吸收和代謝平衡。超表達(dá)玉米DOF1基因能提高擬南芥吸收氮素能力[38]，該基因也能提高生長于低產(chǎn)土壤中水稻的產(chǎn)量，增強(qiáng)氮素吸收利用效率[39]。小麥TaNFYA1-6B和TaNAC2-5A能促進(jìn)根系發(fā)育和激發(fā)NTR1和NRT2家族基因的表達(dá)水平，提高氮素的吸收效率和小麥的產(chǎn)量[40-41]。干旱脅迫下，小麥氮饑餓誘導(dǎo)基因TabZIP2也參與協(xié)調(diào)碳氮代謝平衡，提高小麥抗旱能力[42]。在本文中，葉片或根系中ZmbZIP基因廣泛受硝態(tài)氮或銨態(tài)氮缺乏脅迫的調(diào)控，在葉片或根系有些基因受兩種脅迫處理誘導(dǎo)的表達(dá)模式類似，比如，ZmbZIP3、ZmbZIP68、ZmbZIP74和ZmbZIP101等4個(gè)基因，而其他基因在葉片或根系受2種脅迫處理的影響不同，比如，葉片ZmbZIP27同時(shí)受2種脅迫處理的抑制，而根系中的ZmbZIP27則同時(shí)受到誘導(dǎo)而上調(diào)，表現(xiàn)了該基因在葉片或根系等不同組織中的不同生物學(xué)功能。