閩西南黑兔NPFFR2基因的克隆與序列分析

桑 雷，孫世坤，陳冬金，王錦祥，高承芳，陳巖鋒，謝喜平

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 引 言

【研究意義】閩西南黑兔是福建省優(yōu)良地方品種，抗病力強(qiáng)、繁殖性能好、適應(yīng)性強(qiáng)，肉質(zhì)好，在閩西和閩南地區(qū)深受歡迎[1]。隨著市場的擴(kuò)大，常常需要將閩西南黑兔輸送到離生產(chǎn)場所較遠(yuǎn)的地域進(jìn)行銷售，在運(yùn)輸過程中閩西南黑兔容易產(chǎn)生應(yīng)激。而應(yīng)激會刺激內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic pituitary adrenocortical，HPG）功能失調(diào)[2-3]，從而致使糖皮質(zhì)激素分泌紊亂，最終會引起焦慮，損壞飲食行為、認(rèn)知功能、晝夜節(jié)律和免疫功能[4]。【前人研究進(jìn)展】神經(jīng)肽FF（Neuropeptide FF，NPFF）是RF（精氨酸-苯丙氨酸）氨基肽家族的一員，是哺乳動物體內(nèi)以FLFQPQRFa-NH2形式存在的一種類酰胺化神經(jīng)肽，該家族包括催乳素釋放激素（Prolactin releasing hormone，PRLH）、纈氨酸-苯丙氨酸神經(jīng)肽（Neuropeptide VF，NPVF）以及親吻素（Kisspeptin）等多肽[5]。NPFF主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及性腺、皮膚和腎上腺等外周組織[6-8]。最初，NPFF是從牛腦中分離的具有鎮(zhèn)痛作用的小肽[9]，隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NPFF可以抑制γ-氨基丁酸能（GABAergic）對室旁核小細(xì)胞的投射，通過室旁核直接刺激HPA軸，增加室旁核中c-Fos蛋白的表達(dá)，促進(jìn)下游糖皮質(zhì)激素的分泌和焦慮行為的產(chǎn)生[10]。此外，NPFF還是促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）的一種同源肽，在調(diào)節(jié)生殖、消化、抗炎以及心血管功能等方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。NPFF有兩種前體，分別為proNPFFA和proNPFFB。proNPFFA可以水解為N端含3個特異性氨基酸的NPFF肽以及含NPSF的多肽，proNPFFB則水解產(chǎn)生NPFF和含有LPLRFa的多肽[13]。NPFF主要通過NPFF的受體NPFFR1和NPFF2發(fā)揮生理作用。其中，NPFFR1的特異性較弱，能和多種內(nèi)源性肽結(jié)合，NPFFR2特異性好，與proNPFFA水解得到的NPFF有更高的親和力，也是NPFF的主要受體[14-15]。Lin等報道敲除小鼠的NPFFR2基因，可以使抑制小鼠HPG軸的過度活躍和減緩面對壓力時的焦慮行為[16]。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于閩西南黑兔NPFFR2基因的相關(guān)研究，以及NPFFR2作為抑制NPFF作用和緩解閩西南黑兔運(yùn)輸過程應(yīng)激反應(yīng)的靶位點(diǎn)的相關(guān)研究有待深入進(jìn)行。【擬解決的關(guān)鍵問題】以閩西南黑兔為研究對象，從下丘腦組織中克隆得到NPFFR2基因cDNA全長序列，并對NPFF2基因mRNA序列特征和結(jié)構(gòu)、相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞分布以及該基因的遺傳進(jìn)化進(jìn)行初步分析，以期為閩西南黑兔抗應(yīng)激研究奠定基礎(chǔ)，也為人類抑郁癥的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與組織樣品采集

選用上杭鑫源烏兔合作社飼養(yǎng)的6只90日齡閩西南黑兔（公母各半）作為試驗(yàn)兔，麻醉后屠宰兔子，迅速采集下丘腦組織保存在液氮中備用。

1.2 NPFF2基因的克隆

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 利用總RNA提取試劑盒（Invitrogen，USA）提取閩西南黑兔下丘腦組織中的總RNA，加入DNase I（TaKaRa，Japan）進(jìn)行消化，RNA的含量和純度使用凝膠電泳和Nanodrop 2000紫外分光光度計（Thermo Scientific，USA）進(jìn)行檢測，并調(diào)整總RNA質(zhì)量濃度至1 μg·μL-1。取2 μL總RNA，利用SuperScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，USA）和Oligo（dT）18反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟：在20 μL RNase-free的離心管中分別加入Total RNA 2 μg、Oligo（dT）181 μL、10 μmol·L-1dNTPs 1 μL、添加RNAase-free至15 μL；70 ℃，5 min變性，立即放到冰上；然后依次加入5×第一鏈 buffer 4 μL、0.1 mol·L-1DTT 2 μL、RNAase抑制劑 25 unit，SuperScriptTMII RTase 200 unit，混合上述成分，離心，42 ℃溫浴1 h，-20 ℃保存。

1.2.2NPFRR2基因的擴(kuò)增 參考兔NPFRR2基因預(yù)測序列（Genbank號：XM_017347500.1）設(shè)計保守區(qū)段的擴(kuò)增引物（表1），以閩西南黑兔下丘腦cDNA為模板，通過雙重PCR擴(kuò)增獲得其中間序列。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板（其中第一輪為cDNA原液，第二輪為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）1 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上 下 游 引 物 各1 μL、1.25 unit·μL-1DNA聚合酶 1 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、68 ℃1 min，30個循環(huán)。在1%的瓊脂糖凝膠中電泳所得到PCR產(chǎn)物，對其進(jìn)行切膠回收和測序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers applied

根據(jù)所獲得兔NPFFR2基因的中間序列，設(shè)計5′-RACE、3′-RACE特異引物和驗(yàn)證引物（表1）。5′-RACE和3′-RACE PCR反應(yīng)按照RACE試劑盒（TAKARA SMARTer RACE 5′/3′ Kit）說 明 書 進(jìn)行。將擴(kuò)增出片段分別切膠純化回收后，連接到TVector pMDTM20載體（TaKara），經(jīng)菌落PCR篩選后挑取克隆測序。

用DNAStar 8.0中的SeqMan拼接5′-RACE、3′-RACE和中間序列，得到NPFFR2基因的cDNA全長，并根據(jù)獲得的cDNA全長序列重新設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增后測序驗(yàn)證。驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板2 μL、2×PCR Buffer 25 μL、20 μmol·L-1上下游引物各1 μL、1.25 unit·μL-1DNA聚合酶 1 μL，dH2O 20 μL。驗(yàn)證PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性1 min；98 ℃10 s、55 ℃ 15 s、68 ℃ 1 min，35個循環(huán)。

1.3 NPFF2基因的序列分析

1.3.1 mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 根據(jù)測序結(jié)果用RNAfold Web Server （http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/R NAWebSuite/RNAfold.cgi）在線預(yù)測mRNA的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.2 遺傳進(jìn)化分析 利用遺傳進(jìn)化軟件ClustalX和MEGA-X，對獲得的閩西南黑兔NPFFR2基因cDNA序列和人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、綿羊（Ovis aries）、貓（Felis catus）、狗（Canis lupus familiaris）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）等物種進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，其中人、豬、綿羊、貓、狗、大鼠、小鼠等其他物種cDNA序列自NCBI基因數(shù)據(jù)庫下載。采用NJ法（Neighbor-Joining Methods）進(jìn)行分析，計算重復(fù)1000次（Bootstrap=1000），繪制遺傳進(jìn)化樹。

1.3.3 蛋白基本理化特性分析 利用在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析閩西南黑兔NPFFR2蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)、等電點(diǎn)、平均疏水指數(shù)和脂肪族氨基酸指數(shù)。

1.3.4 蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、PredictProtein（https://predictprotein.org/）和SWISS－ MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對閩西南黑兔NPFFR2蛋白結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 NPFFR2基因的克隆

以閩西南黑兔下丘腦總RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。用引物NPFFR2-F1/R1和NPFFR2-F2/R2進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1.5 kb左右可見明亮的條帶，條帶大小與設(shè)計的目的片段長度基本一致（圖1-A）。回收后進(jìn)行測序，得到該片段序列，經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫兔NPFFR2基因預(yù)測序列比對，確認(rèn)獲得的序列為兔NPFFR2基因編碼區(qū)部分序列。經(jīng)過5′-RACE兩輪PCR擴(kuò)增，在600 bp左右得到預(yù)期的條帶（圖1-B），將上述條帶回收克隆測序后與預(yù)測序列比對，發(fā)現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果相符。而3′-RACE PCR擴(kuò)增也在600 bp左右獲得較彌散的擴(kuò)增帶（圖1-C）。

圖1 閩西南黑兔NPFFR2基因電泳結(jié)果Fig. 1 PCR amplification of NPFFR2

2.2 NPFFR2基因變異

將2.1獲得的片段切膠回收克隆到載體中，涂抹平板挑選多個菌落測序，比對后發(fā)現(xiàn)有兩個克隆序列在3′-UTR（Untranslated region，非翻譯區(qū)）存在差異序列，且都與預(yù)測序列相關(guān)（圖2），因此推測NPFFR2基因可能存在2個異構(gòu)體，暫時分別命名為轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體1（Transcript variant 1）和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體2（Transcript variant 2）（圖2）。將 所有序 列通過Seqman軟件拼接到一起，根據(jù)拼接序列重新設(shè)計引物NPFFR2-F5/R5進(jìn)行RACE擴(kuò)增后，獲得1.8 kb左右的條帶（圖1-D），擴(kuò)增出來的序列與預(yù)計長度大小一致。NPFFR2基因的兩個異構(gòu)體（cDNA全長分別為1815 bp和1824 bp）擁有相同的79 bp 5′-UTR，相同的1245 bp編碼區(qū)，只是在3′-UTR存在差異，分別為491 bp和500 bp（圖2）。

圖2 閩西南黑兔NPFFR2基因cDNA序列3′-UTR的序列比對Fig. 2 Alignment of 3′-UTR cDNA sequence of NPFFR2 from Minxinan black rabbit

2.3 兔NPFFR2基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

采用RNAfold Web Server在線軟件預(yù)測NPFFR2基因不同轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體mRNA二級結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，3′-UTR 78、84、113-116、123、128-129、302、340、344-349和367的核酸突變會改變NPFFR2基因mRNA二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體部分結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯差異（圖2和圖3）。

圖3 NPFFR2基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig. 3 Predicted secondary mRNA structure of NPFFR2

2.4 NPFFR2氨基酸序列分析

通過在線工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）推算NPFFR2基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼414個氨基酸，蛋白分子量47.083 kDa，理論等電點(diǎn)9.21，不穩(wěn)定系數(shù)為42.86，半衰期30 h，脂肪族氨基酸指數(shù)106.43，平均疏水指數(shù)0.292。利用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、Predict Protein（https://predictprotein.org/）和SWISS－MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對閩西南黑兔NPFFR2蛋白結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白為跨膜蛋白，存在7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于48～70氨基酸、82～104氨基酸、124～146氨基酸、159～181氨基酸、218～240氨基酸、271～293氨基酸和313～335氨基酸，胞外區(qū)位于1～46氨基酸、105～122氨基酸、183～217氨基酸和296～311氨基酸，胞內(nèi)區(qū)則位于其余氨基酸（圖4）。

圖4 閩西南黑兔NPFFR2蛋白的結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig. 4 Predicted structure and subcellular localization of NPFFR2 of Minxinan black rabbit

2.5 NPFFR2基因的遺傳進(jìn)化分析

利用clustalX和MEGA-X軟件將克隆的2條閩西南黑兔轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體與人（3個異構(gòu)體：NM_004885.3、NM_053036.3和NM_001144756.2）、小鼠（NM_133192.3）、大鼠（NM_023980.1）、豬（4個異構(gòu)體：XM_021101419.1、XM_021101420.1、XM_021101421.1和XM_021101422.1）、綿羊（KC119399.1）、貓（XM_023253059.1和XM_003985291.5）、狗（XM_003639453.5）、負(fù)鼠（XM_001374915.2）、雞（NM_001034825.2）、草龜（XM_039541327.1）、非洲爪蛙（XM_002940351.5）、紅鰭東方鲀（NM_001098648.1）12物種18個核酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。采用Neighbor-Joining法，進(jìn)行1000次重復(fù)檢測，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明兔和人類遺傳距離最近；其次為與狗、貓、綿羊、豬、小鼠、大鼠和負(fù)鼠；與紅鰭東方鲀、非洲爪蛙、雞、龜?shù)确遣溉閯游锏倪z傳距離最遠(yuǎn)（圖5）。

圖5 閩西南黑兔NPFFR2基因與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 5 Phylogenetic trees of NPFFR2 of Minxinan black rabbit and other animal species

3 討論與結(jié)論

NPFF主要通過與NPFFR2結(jié)合后發(fā)揮調(diào)節(jié)阿片鎮(zhèn)痛和抗焦慮等功能[16]。NPFFR2屬于G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR），這類受體的三級結(jié)構(gòu)中有7個跨膜的α螺旋，在第5和第6跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)有鳥苷酸結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，即位于兔NPFFR2蛋白241～270氨基酸，與配體結(jié)合后NPFFR2構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致G蛋白發(fā)生激活，進(jìn)而調(diào)控ERK和NF-κB通路，引起細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變[17-18]。

本研究借助RACE技術(shù)，從閩西南黑兔的下丘腦組織中克隆出NPFFR2基因的cDNA序列全長，獲得了2個轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，人、豬、貓等哺乳動物的NPFFR2基因也存在多個轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。序列比對結(jié)果顯示，閩西南黑兔NPFFR2基因轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體核酸變異主要發(fā)生在3′-UTR，而人、豬、貓等動物轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的核酸變異主要集中在5′-UTR，可能與品種和組織特異性有關(guān)[19]。3′-UTR是位于mRNA編碼區(qū)序列3′-端的非翻譯區(qū)，是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)區(qū)域，其通過與微小核糖核酸（Micro ribonucleic acid，miRNA）結(jié)合，對mRNA的亞細(xì)胞定位、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯等生物學(xué)過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[20]。例如，李素雅等報道雞Lpin1基因3′-UTR g.77C＞G變異會引起多個miRNA結(jié)合位點(diǎn)丟失/增加[21]。陳安利等報道家蠶卵黃膜蛋白基因BmVMP233′-UTR 核酸發(fā)生變異，從而導(dǎo)致其表達(dá)量明顯下降[22]。3′-UTR與動物生產(chǎn)性能和人類疾病密切相關(guān)，該區(qū)域的變異有可能引起基因的表達(dá)異常，從而影響動物的生產(chǎn)性能或?qū)е录膊〉陌l(fā)生[23]。孫渭博等研究發(fā)現(xiàn)，骨成型蛋白受體1B基因（BMPR-1B）3′-UTR上1354位堿基A→G突變會影響綿羊胎產(chǎn)羔數(shù)[24]。此外，王芬等發(fā)現(xiàn)糖原合成酶激酶 3β 基因（GSK3B）3′-UTR存在多個與阿爾茨海默病相關(guān)的突變位點(diǎn)[20]。通過RNAfold Web Server在線軟件預(yù)測兔NPFFR2基因轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，3′-UTR的多個變異導(dǎo)致NPFFR2基因mRNA二級結(jié)構(gòu)部分區(qū)域發(fā)生明顯變化，結(jié)構(gòu)的變化必然會導(dǎo)致miRNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，對NPFFR2轉(zhuǎn)錄勢必有影響，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究分離克隆了閩西南黑兔NPFFR2基因的2種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，并利用生物信息學(xué)方法對其轉(zhuǎn)錄本和翻譯蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測，從而為進(jìn)一步高效利用閩西南黑兔NPFFR2基因提供理論支持，對兔抗應(yīng)激研究貢獻(xiàn)力量。