生姜生物活性成分的合成分析與抗運(yùn)動(dòng)病應(yīng)用研究

蔡明亮，劉 琦，徐麗華，周 鑫，姜正林

（南通大學(xué) 特種醫(yī)學(xué)研究院， 江蘇 南通 226019）

1 問(wèn)題提出

運(yùn)動(dòng)病多發(fā)生在乘車、乘船與航天等特殊環(huán)境下，主要癥狀有流涎、胃部不適、嗜睡、面色蒼白、出冷汗、眩暈、惡心、甚至嘔吐等[1]。目前，抗運(yùn)動(dòng)病藥物主要有抗組胺藥，代表藥物為茶苯海明；抗膽堿藥，代表藥物為東莨菪堿；擬交感神經(jīng)藥，代表藥物有哌唑甲酯[2]。除了以上化學(xué)藥物外，還有些中藥材如丹參、天麻、生姜等均能防止運(yùn)動(dòng)病的發(fā)生，對(duì)運(yùn)動(dòng)病癥狀有一定的緩解作用。

生姜被認(rèn)為是較理想的天然抗運(yùn)動(dòng)病藥物之一，幾乎沒(méi)有副作用，因此被人們廣泛研究[3-4]。目前，生姜已被開(kāi)發(fā)出很多復(fù)方制劑，其抗運(yùn)動(dòng)病效果受到肯定，但是生姜的具體抗運(yùn)動(dòng)病成分及機(jī)制還不十分清楚。生姜中發(fā)現(xiàn)的成分有100 多種，其中姜酚是主要的生物活性成分。根據(jù)支鏈上所連的碳鏈長(zhǎng)短不同，姜酚又可分為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中以6-姜酚的含量最高，生物活性最強(qiáng)[5]。因此，6-姜酚被認(rèn)為是最有效的生姜活性成分。

現(xiàn)有技術(shù)不僅可進(jìn)行生姜活性成分的提純，也可通過(guò)化學(xué)合成的方法得到所需的各種有效成分。本研究通過(guò)逆向推理，以香蘭素和丙酮為原料[6]，通過(guò)羥醛縮合等化學(xué)反應(yīng)得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。對(duì)合成的三種代表性生姜生物活性成分進(jìn)行分析鑒定，并以旋轉(zhuǎn)刺激誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生對(duì)0.15 %糖精水的條件性厭飲行為作為運(yùn)動(dòng)病模型，觀察其抗運(yùn)動(dòng)病作用，明確生姜生物活性成分的抗運(yùn)動(dòng)病效果，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)使用該藥提供依據(jù)。

圖1 6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮的結(jié)構(gòu)式

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲醇（分析純），氫氧化鈉（分析純），乙醇（分析純），乙酸乙酯（分析純），石油醚（分析純），四氫呋喃（分析純），二異丙胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），香蘭素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），丙酮（分析純），鹽酸（分析純），鈀—碳（Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），6-姜酚（Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），6-姜烯酚（北京百靈威科技有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（上海華聯(lián)環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備公司恒昌儀器廠，HH-S21-6S），旋轉(zhuǎn)刺激裝置（南通大學(xué)自主研制），各種量程移液器（2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，德國(guó)艾本德股份公司），恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器廠有限公司，90-3），高效液色譜相儀（日本島津公司，LC-20AD）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 6-姜酚系列化合物的合成

6-姜酚系列化合物的合成路線如圖2 所示。

圖2 6-姜酚系列化合物的合成反應(yīng)式

以香蘭素為原料[6-7]，氫氧化鈉為催化劑，在丙酮作為溶劑的條件下得到脫氫姜酮，以Pd/C 為催化劑，通過(guò)氫氣還原制備得到姜酮中間體。將姜酮與正己醛在無(wú)水四氫呋喃的溶劑中，以LDA 為催化劑，-78 ℃低溫反應(yīng)（丙酮+干冰），即可制備目標(biāo)化合物6-姜酚。以6-姜酚為原料，稀鹽酸（2 mol/L）為催化劑，在四氫呋喃的回流條件下即可制備6-姜烯酚。以6-姜烯酚為原料，在Pd/C為催化劑的氫氣還原條件下，即可制備另一目標(biāo)化合物6-姜烯酮。

2.3.2 催化劑二異丙基氨基鋰（LDA）的制備

二異丙基氨基鋰（LDA）作為催化劑具有一定危險(xiǎn)性，不可長(zhǎng)期保存，因此，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)制備，反應(yīng)式如圖3。

圖3 二異丙基氨基鋰的制備反應(yīng)式

將二異丙胺10.5 mL 溶于50 mL 無(wú)水四氫呋喃溶劑，并加入裝有滴液漏斗的250 mL 三口瓶，氮?dú)獗Ｗo(hù)，密封瓶口。然后在-78 ℃下攪拌，緩慢滴加用40 mL 無(wú)水四氫呋喃稀釋的正丁基鋰30 mL（2.5 mol/L），持續(xù)30 min。逐漸回復(fù)溫度至0 ℃，攪拌 10 min，將溫度再次恢復(fù)至-78 ℃[7]，得到二異丙基氨基鋰。

2.3.3 藥物純度檢測(cè)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，合成得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮三種化合物，用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其純度。三種化合物均為脂溶性藥物，選擇甲醇為溶劑，高效液相的流動(dòng)相為甲醇和水。高效液相法的檢測(cè)條件為：室溫27 ℃，流動(dòng)相為甲醇和水的混合液（V甲醇∶V水=13 ∶7），流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3.4 大鼠運(yùn)動(dòng)病模型

實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放入旋轉(zhuǎn)裝置的有機(jī)玻璃籠內(nèi)，繞水平軸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，以16 °/s2角加速度加速，達(dá)到最大速度 120 °/s2后，立即以-48 °/s2的角加速度減速，至旋轉(zhuǎn)停止為一個(gè)旋轉(zhuǎn)周期，歷時(shí)10 s，再反方向重復(fù)刺激，持續(xù)旋轉(zhuǎn)刺激2 h。

2.3.5 運(yùn)動(dòng)病敏感性分組

采用旋轉(zhuǎn)刺激誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生條件性味覺(jué)厭惡（conditional taste aversion，CTA）的方法制作大鼠運(yùn)動(dòng)病模型后，進(jìn)行大鼠運(yùn)動(dòng)病敏感性分組。給大鼠編號(hào)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 天后，給予0.15 % 糖精水適應(yīng)24 h。首日上午始禁水24 h，次日上午給予0.15 % 糖精水，大鼠自由飲用45 min，測(cè)量各大鼠飲用量。隨后自由飲水一天。第三天對(duì)大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)刺激2 h 后禁水24 h。第四天讓其自由飲用0.15 % 糖精水45 min，再次測(cè)量各大鼠飲用量。環(huán)境溫度保持在25 ℃。計(jì)算旋轉(zhuǎn)刺激后各大鼠糖精水飲用量減少程度，減少15 %以上的為敏感組，減少15 %以下為不敏感組。一周后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，兩次結(jié)果一致的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.6 生姜抗運(yùn)動(dòng)病有效成分篩選

選取敏感SD 大鼠，利用拉丁方設(shè)計(jì)，對(duì)藥物進(jìn)行篩選（見(jiàn)表 1）。其中：A 為空白，B 為花生油，C 為 25 mg/kg 6-姜酚，D 為 50 mg/kg 6-姜酚，E 為 50 mg/kg 6-姜烯酚，F(xiàn) 為 100 mg/kg 6-姜烯酚，G 為 50 mg/kg 6-姜烯酮，H 為 150 mg/kg 6-姜烯酮，I 為 60 mg/kg 茶苯海明。由于 6-姜酚、6-姜烯酚和6-姜烯酮均為脂溶性藥物，故選擇花生油作為三種藥物的溶劑。茶苯海明為顆粒固體藥物，用生理鹽水溶解。

對(duì)篩選出的敏感大鼠進(jìn)行編號(hào)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 天后，給予0.15 %糖精水適應(yīng)24 h。首日上午禁水24 h，次日上午給予0.15 % 糖精水，自由飲用45 min，測(cè)量各大鼠飲用量。隨后自由飲水一天。第三天，在對(duì)大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)刺激前半小時(shí)，按表1的順序?qū)Υ笫筮M(jìn)行灌胃給藥，然后旋轉(zhuǎn)刺激2 h后禁水24 h。第四天讓其自由飲用0.15 %糖精水45 min，再次測(cè)量各大鼠飲用量。每周一次，共進(jìn)行9 次實(shí)驗(yàn)。

表1 拉丁方設(shè)計(jì)藥物篩選表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化學(xué)合成藥物結(jié)構(gòu)確定

使用核磁氫譜、高效液相色譜方法對(duì)三種化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

5-羥基-1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）癸-3-酮（6-姜酚）：1HNMRδ 0.88（3H，s），1.21-1.53（8H，m），2.52（2H，m），2.73（2H，m），2.83（2H，m），2.99（1H，s），3.88（3H，s），4.03（1H，m），5.56（1H，s），6.66（2H，m），6.84（1H，d，J=8.0 Hz）；根據(jù)電子轟擊源質(zhì)譜（EI-MS）結(jié)果，計(jì)算得到6-姜酚的分子量為 294.182 5（圖 4（a））。對(duì)照品和合成化合物在薄層色譜上顯示一個(gè)斑點(diǎn)，Rf=0.68。產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相檢測(cè)后保留時(shí)間一致，在13 min 左右，如圖 4（b）、（c）所示。

圖4 合成品6-姜酚結(jié)構(gòu)分析

1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）癸-4-烯-3-酮（6-姜烯酚）：1H NMRδ 0.89（3H，t，J = 6.6 Hz），1.30（4H，m），1.45（2H，m），2.19（2H，q，J=7.2 Hz），2.85（4H，m），3.87（3H，s），5.53（1H，s），6.10（1H，d，J = 16.0 Hz），6.68（2H，m），6.82（2H，m）；根據(jù)電子轟擊源質(zhì)譜（EI-MS）結(jié)果，計(jì)算得6-姜烯酚的分子量為 276.371 5（圖 5（a））。標(biāo)準(zhǔn)品與合成化合物在薄層色譜上顯示一個(gè)斑點(diǎn)，Rf=0.55。高效液相檢測(cè)后保留時(shí)間一致，在30 min 左右，見(jiàn)圖5（b）、（c）。

圖5 合成品6-姜烯酚結(jié)構(gòu)分析

1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-3-癸酮（6-姜烯酮）：1H NMRδ 0.89（3H，t），1.26-1.30（8H，m），1.56（2H，J=7.2 Hz），2.39（2H，J=7.4 Hz），2.71（2H，J=7.4 Hz），2.84（2H，J=7.4 Hz），3.88（3H，s），5.62（1H，s）6.67-6.71（2H，m），6.84（1H，m）。根據(jù)電子轟擊源質(zhì)譜（EI-MS）結(jié)果，計(jì)算得到6-姜烯酮的分子量為 278.2015 ，如圖 6（a）所示。

圖6 合成品6-姜烯酮結(jié)構(gòu)分析

3.2 化合物純度測(cè)定

利用高效液相色譜法對(duì)化合物進(jìn)行純度分析，根據(jù)高效液相圖譜分析得到峰面積的比例。圖 4（b）和（c）顯示，6-姜酚合成化合物和標(biāo)準(zhǔn)品都是在13 min 左右出峰，合成的6-姜酚占對(duì)照品的峰面積比例為98.4 %，因此藥物的純度與對(duì)照品接近。圖 5（b）和（c）顯示，HPLC 出峰時(shí)間有微小偏差，但在允許范圍內(nèi)。合成的6-姜酚和6-姜烯酮有肩峰，表明所合成的6-姜酚和6-姜烯酮純度較 6-姜酚低（圖 5（c）和圖 6（b））。如圖 6（b）顯示，在8 min 和10 min 左右出現(xiàn)了顯著雜峰，這也影響6-姜烯酮的純度。

3.3 生姜有效成分的抗運(yùn)動(dòng)病效果

采用拉丁方設(shè)計(jì)，循環(huán)9 個(gè)周期，每個(gè)周期為7 天，對(duì)藥物的抗運(yùn)動(dòng)病效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，對(duì)照組1 和對(duì)照組2 兩組大鼠糖精水飲用量減少程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。陽(yáng)性對(duì)照藥茶苯海明抑制大鼠的糖精水厭飲行為（P ＜0.05），6-姜烯酮兩個(gè)劑量50 mg/kg 和150 mg/kg 組與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。6-姜酚和6-姜烯酚均抑制大鼠糖精水厭飲行為（P ＜0.05 或0.01），其中6-姜酚50 mg/kg 作用優(yōu)于25 mg/kg劑量，6-姜烯酚100 mg/kg 作用優(yōu)于50 mg/kg 劑量，但與陽(yáng)性藥對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05，見(jiàn)圖 7）。上述結(jié)果表明，6-姜酚 50 mg/kg 劑量時(shí)，抑制大鼠的糖精水厭飲行為效果最佳。

圖7 生姜有效成分合成品的抗運(yùn)動(dòng)病效果（n=9）

4 討 論

本研究首先通過(guò)縮合、還原等化學(xué)合成方法，以香蘭素和丙酮為原料合成得到6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮。以質(zhì)譜和核磁共振法對(duì)三種化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，高效液相色譜分析其純度。結(jié)果顯示，各化學(xué)合成物核磁表征與標(biāo)準(zhǔn)品吻合且有效成分的純度均較高。表明本實(shí)驗(yàn)采用的以香蘭素和丙酮為原料合成6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮的方法良好。

后續(xù)以旋轉(zhuǎn)刺激誘導(dǎo)條件性厭飲作為大鼠運(yùn)動(dòng)病模型，以旋轉(zhuǎn)刺激后0.15 %糖精水飲用量的減少程度衡量運(yùn)動(dòng)病的發(fā)作程度，并評(píng)價(jià)藥物的作用。結(jié)果顯示，與茶苯海明比較，6-姜烯酮的抗運(yùn)動(dòng)病效果不明顯，而6-姜酚、6-姜烯酚具有較好的抗運(yùn)動(dòng)病效果，能明顯抑制大鼠旋轉(zhuǎn)刺激后糖精水飲用量的減少，特別是6-姜酚50 mg/kg 劑量的作用最強(qiáng)。6-姜酚與6-姜烯酚兩種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式非常相似（圖1），從合成化學(xué)角度看，6-姜烯酚可以由6-姜酚一步合成而來(lái)，在支鏈上，原本的6-姜酚上-OH 脫水形成一個(gè)C=C 雙鍵，即變成6-姜烯酚，而其母環(huán)和主要官能團(tuán)未發(fā)生改變，因此這兩種化合物應(yīng)屬于一種類型的藥物，兩者的作用機(jī)制應(yīng)是一致的。

依據(jù)構(gòu)效關(guān)系來(lái)比較6-姜酚和6-姜烯酚，可以看出6-姜酚含有-OH，親水性增強(qiáng)，使藥物更容易進(jìn)入體液，6-姜烯酚因其含有C=C 雙鍵，親脂能力更強(qiáng)，藥物更容易通過(guò)血腦屏障發(fā)揮中樞作用。但是，任何一種藥物透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞發(fā)揮藥效，除要具有一定的親脂能力外，一定的親水能力也十分必要，兩者達(dá)到恰當(dāng)?shù)闹峙洳拍馨l(fā)揮最大的藥效[8]。6-姜烯酮（圖1）的支鏈為一些飽和烷烴鏈，其親脂能力比6-姜烯酚更強(qiáng)，相對(duì)親水能力減弱，其脂水分配更加不均，導(dǎo)致藥效無(wú)法發(fā)揮。

5 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)合成得到生姜抗運(yùn)動(dòng)病有效成分6-姜酚、6-姜烯酚、6-姜烯酮，且對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行了高效液相色譜純度檢測(cè)、核磁共振氫譜表征及藥效學(xué)評(píng)估。結(jié)果表明，三種化合物核磁氫譜數(shù)據(jù)及液相色譜數(shù)據(jù)與對(duì)照品吻合，且各有效成分的純度較高。合成的三種化合物中，6-姜酚和6-姜烯酚與陽(yáng)性對(duì)照藥茶苯海明一樣能抑制大鼠的糖精水厭飲行為，且50 mg/kg 劑量的6-姜酚效果最好。