硝化應激在神經型犬瘟熱疾病發展中的臨床意義

朱道仙，劉莉*,陸江，趙學剛，郝福星

(1. 江蘇農牧科技職業學院動物醫學院，江蘇 泰州 225300；2. 江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院，江蘇 泰州 225300)

硝化應激(nitrosative stress)是指在致病因素下，機體產生的過量高活性含氮分子可以導致細胞損傷的病理過程[1]。大量研究表明，硝化應激可以引起多種疾病，包括內皮功能障礙、心血管疾病和神經血管疾病等[2-5]。在腦內一氧化氮(NO)是一種重要神經遞質，主要由神經元型一氧化氮合酶(nNOS)合成，同時也是參與硝化應激的重要物質，與神經疾病的發生發展關系密切[6]。

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的犬科動物一種常見的病毒性疾病，主要表現為呼吸道癥狀、消化道癥狀、皮膚癥狀和神經癥狀等。臨床研究表明，神經型犬瘟熱的死亡率較高，治愈率僅為10%左右[7]。尋找對神經型犬瘟熱有早期診斷或預測價值的生物標志物以及治療新靶點具有重要意義。以前的研究表明，犬科動物的神經系統疾病表現為白色和灰色物質的多發性脫髓鞘損傷，這可能是由于在病毒感染過程中自由基的過度產生和積聚所致[8]。因此，本試驗以犬瘟熱臨床病例為對象，研究硝化應激在神經型犬瘟熱病理過程中的作用，探討血漿和腦脊液中NO、nNOS和神經元特異性烯醇化酶(NSE)水平在神經型犬瘟熱臨床病例篩選中的應用價值，為神經型犬瘟熱診斷與預后提供新方法。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2018年1月到2019年9月期間，到江蘇農牧科技職業學院教學寵物醫院就診的診斷為犬瘟熱的患犬155例，剔除隨訪失敗或放棄治療以及伴有其他疾病的病例(42例)后，出現以下神經癥狀如震顫或癲癇、肌陣攣、共濟失調、四肢輕癱或癱瘓等患犬納入神經癥狀組(NCD)，共37例，其余76例納入無神經癥狀組(NNS)。同時選取無犬瘟熱健康犬25例作為對照組(CG)。本試驗納入研究犬的基本資料見表1，可以看出，各組犬均以純種犬為主，性別構成無顯著差異，年齡分布于5月齡到7月齡，體重2.5～3.5 kg之間，主要以飼喂商品糧為主。

表1 納入研究病例的基本特征

1.2 方法

1.2.1 CDV的診斷標準

采集鼻分泌物后，用CDV抗原膠體金診斷試劑盒(購于韓國安捷動物診斷試劑有限公司)對納入病例進行初步診斷。陽性者進一步進行CDV核酸檢測(RT-PCR熒光探針法，試劑盒購于上海研生實業有限公司)，按說明書進行結果判斷：Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長為陽性；35.037 或無Ct值為陰性。

1.2.2 血液樣本采集

從橈外側靜脈無菌采血3 mL，轉移到含有EDTA抗凝劑的小瓶中后以3 000 r/min，離心15 min，制備血漿并儲存在-20 ℃下，備用。

1.2.3 腦脊液采集

用846合劑按0.05 mL/kg肌肉注射麻醉犬后，觸摸到枕骨大孔凹陷處，取7號針頭(針尖磨鈍)，由凹陷順平行犬嘴的方向小心地刺入小腦延髓池。當針頭阻力突然消失時，回抽獲得腦脊液，確定腦脊液量方法為每5 kg體重抽取1 mL。抽取后，需向小腦延髓池注入等量的生理鹽水，以保證腦脊髓腔內的壓力。

1.3 硝化應激指標檢測

1.4 數據統計與分析

數據采用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析。結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 硝化應激指標的變化

通過圖1可以發現，與CG組比較，NNS組血漿和腦脊液中NO水平顯著升高(P<0.05)，NCD組極顯著升高(P<0.01)，且NCD組顯著高于NNS組(P<0.05)。血漿中nNOS水平變化較大，NCD組的水平最高，NNS組次之，CG組最低，各組間差異顯著(P<0.05或P<0.01)。NCD組腦脊液中nNOS水平分別高于NNS組(P<0.05)和CG組(P<0.01)，且均高于各自血漿中水平。犬瘟熱感染后腦脊液和血漿中NSE水平均升高，與CG組比較，NNS組差異顯著(P<0.05)，NCD組差異極顯著(P<0.01)，NCD組與NNS組之間也有顯著差異(P<0.05)。

a.NO；b.nNOS；c.NSE

2.2 硝化應激指標對神經型犬瘟熱的預測分析

根據不同二分類方式，以靈敏度為縱坐標，以1-特異性為橫坐標，分別將血漿中和腦脊液中的各指標進行了ROC曲線分析。可以看出，以NCD組與CG組作二分類分析時，NO、nNOS與NSE的ROC曲線AUC均大于0.5，對神經型犬瘟熱具有診斷意義。血漿中nNOS的ROC曲線的AUC最大，靈敏度最高，診斷臨界值為195.4 ng/mL(圖2a)；腦脊液中NSE的預測作用最好，診斷臨界值為2.94 ng/mL(圖2c)。以NCD組與NNS組作二分類分析時，NO、nNOS與NSE的ROC曲線AUC有所降低，血漿中nNOS的AUC最大，診斷臨界值為230.1 ng/mL(圖2b)；腦脊液中NSE最大，診斷臨界值為3.67 ng/mL(圖2d)。

2.3 硝化應激指標對神經型犬瘟熱的預后價值分析

對NCD組的所有病例進行了50 d的隨訪，并以各個指標的平均值為分割點，將NCD組病例分成2個亞組：低于平均值組(

a、c.NCD組和CG組比較；b、d.NCD組和NNS組比較；a和b為血漿中水平；c和d為腦脊液中水平

a.血漿；b.腦脊液；c.血漿中NSE的生存曲線

3 討論

犬瘟熱是由CDV感染引起的危害犬科、貓科及浣熊科等動物一種疾病，病死率高達80%～90%。近年來，對于犬瘟熱的診斷取得很大進展，免疫膠體金技術由于使用方便，價格低廉，已廣泛應用于臨床，但存在敏感性和特異性略低的缺點[10]。而RT-PCR技術在犬瘟熱診斷中具有較高的敏感性和特異性[11]。本研究對于犬瘟熱的診斷采用了膠體金技術進行初篩，進一步用RT-PCR驗證，提高了納入病例的準確性。

研究表明，NO是一種極不穩定氣體自由基，可引起硝化應激，由NOS催化氧化L-精氨酸合成并釋放，在中樞神經系統中主要由nNOS合成，廣泛分布于哺乳動物的各種組織中特別是神經組織。NO具有細胞間第二信使作用的多效應分子，其生物學效應具有雙重性，已證實低濃度NO在大腦神經調節和神經傳遞等方面發揮重要作用，當NO過量時，則成為神經毒物，是腦損傷的關鍵因子，參與多種炎癥過程，導致神經元凋亡，誘導疾病發生[12]。神經癥狀是CDV進入中樞神經引起脫髓鞘性犬瘟熱腦炎所致，但發病的分子機制不詳。本研究結果發現，神經型犬瘟熱病例的腦脊液與血漿中的NO和nNOS水平均高于非神經型犬瘟熱和健康犬，說明硝化應激可能是神經型犬瘟熱的發病機制之一。ROC曲線顯示，不論是腦脊液還是血漿中，NO、nNOS的ROC曲線下面積均大于0.8，對神經型犬瘟熱的診斷具有較高的靈敏度和特異性。

NSE存在于腦脊液和全身循環中，可作為檢測神經元損傷的標志物[13]。在本研究中，NCD組病例血漿中NSE水平高于NNS和CG組，腦脊液中NSE水平甚至是NNS組的2倍，CG組的5倍，這些結果表明了神經損傷是神經型犬瘟熱主要的病理機制。生存曲線分析結果表明神經損傷程度與預后關系密切，NSE水平越高，其死亡率越高，治愈率就越低。因此，可以推斷神經型犬瘟熱發生發展中伴有神經損傷過程，可能是由于硝化應激造成的，也提示了硝化應激可能成為神經型犬瘟熱治療的新靶點。

綜上所述，硝化應激在神經型犬瘟熱發展過程中具有重要作用，血漿和腦脊液中的NO、nNOS和NSE可作為該病診斷及預測的生物標志物，而且NSE對該病具有較高的預后價值。