miR-1307在豬卵巢顆粒細胞周期中的作用

李建，姚望，杜星，潘增祥，李齊發

(南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095)

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長度20～22個核苷酸的非編碼RNA分子(non-coding RNAs，ncRNAs)。研究發現，miRNAs主要通過轉錄后水平沉默靶基因表達，進而在各種組織和器官的多種細胞生理和病理過程中發揮至關重要的作用[1-2]。在哺乳動物卵巢組織中，miRNAs在卵母細胞、體細胞(如顆粒細胞)和卵泡液中廣泛表達，并調控多種卵巢功能，從原始卵泡庫的維持和起始，到排卵、黃體形成和卵巢老化[2-4]。在各種卵巢細胞中，卵巢顆粒細胞中miRNAs的研究最為深入，涉及各種顆粒細胞功能，如顆粒細胞增殖[5]、顆粒細胞凋亡[2]、顆粒細胞自噬[6]、類固醇激素分泌[7]和細胞周期等[8]。目前靶向卵巢顆粒細胞凋亡的miRNAs研究最多，如miR-26b[5]、miR-425[9]、miR-1306[10]和miR-204[11]等。基因內miR-126通過靶向抑制TGFB2基因，抑制卵巢顆粒細胞中TGF-β信號通路，進而促進顆粒細胞凋亡和卵泡閉鎖，介導高繁殖力候選基因NORFA對豬繁殖性能的調控[2]。眾所周知，芳香化酶P450arom是卵巢顆粒細胞中雌激素合成通路的限速酶，其編碼基因CYP19A1被發現受多個miRNAs如miR-1275[5]、miR-10b[12]和miR-27a-3p[13]等的直接或間接調控，從而介導miRNAs對顆粒細胞雌激素分泌的調控。但目前關于靶向調控卵巢顆粒細胞周期的miRNAs研究較少[8,14]。本文以豬卵巢顆粒細胞為研究對象，利用流式細胞技術分析miR-1307在顆粒細胞周期中的作用，以期為解析哺乳動物細胞周期的miRNAs調控網絡提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用新鮮卵巢來自南京祿口機場屠宰場的成年杜長大商品母豬。用75%酒精消毒后的手術剪將剛屠宰的母豬輸卵管末端的卵巢剪下，簡單清洗后將卵巢浸泡在37 ℃的生理鹽水中，盡快運送回實驗室。

1.2 主要試劑

試驗用主要試劑有：DMEM/F-12培養基、胎牛血清(FBS)、Opti-MEM培養基、青霉素/鏈霉素雙抗(PS)(Gibco公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(HyClone公司)；胰蛋白酶-EDTA(0.05%)(Thermo公司)、Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen公司)；細胞周期檢測試劑盒(Vazyme 公司)。

1.3 試驗儀器

試驗所用儀器主要包括：二氧化碳培養箱(MCO-18AIC)(Panasonic公司)、離心機(TDZ4-WS)(長沙湘智公司)、超凈工作臺(蘇凈安泰公司)、流式細胞儀(Beckman Coulter公司)、光學顯微鏡(YSA100)(Nikon)和微量移液器(Thermo公司)等。

1.4試驗方法

1.4.1 生物信息學分析

豬等哺乳動物miR-1307前體和成熟體序列下載自NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)和miRBase數據庫(http://www.mirbase.org/)。利用DNAMAN軟件進行序列堿基組成和多重比對分析。利用在線軟件RNA structure(http://rna.urmc.rochester.edu/RNA structureWeb/)預測miR-1307前體的二級結構。使用在線軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預測miR-1307的靶基因。利用在線軟件DAVID(https://david-d.ncifcrf.gov/)進行GO分析和KEGG功能富集分析。

1.4.2 細胞培養

將采集的母豬卵巢放在37 ℃無菌生理鹽水中，75%酒精和PBS清洗卵巢3～5次后，用10 mL注射器抽取直徑為3～5 mm卵泡的卵泡液。1 000 r/min離心5 min，去除卵泡液；PBS清洗2遍顆粒細胞，1 000 r/min離心5 min后去除PBS；用DMEM/F-12培養基重懸混勻細胞。將細胞接種于T25培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養；24 h后觀察細胞貼壁情況，將未貼壁的細胞用移液槍吸棄；用PBS清洗細胞，更換新鮮培養基，待細胞長滿培養瓶底部且狀態良好時鋪板。用5 mL PBS重復清洗細胞2遍，加入1 mL的胰酶孵育2 min以消化細胞，顯微鏡下觀察到細胞狀態，充分漂浮后立即加入等體積的培養基終止消化。1 000 r/min 離心5 min，去除胰酶和培養基混合液；加入DMEM/F-12培養基重懸混勻細胞，接種于12孔或6孔細胞培養板中，置于培養箱中培養。

1.4.3 小分子RNA合成

由上海吉瑪公司設計合成豬miR-1307模擬物(mimics)、抑制劑(inhibitor)和相應的陰性對照(NC)等小分子RNA。詳細序列見表1。

表1 小分子RNA序列

1.4.4 細胞轉染

豬卵巢顆粒細胞在6孔板中進行培養。待每孔長到80%～90%時，利用Lipofectamine2000轉染試劑將小分子RNA轉染到細胞中。轉染時的培養基是不含胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培養基，轉染4 h后將培養基換成含有15% FBS和2% PS的DMEM/F-12培養基。詳細的轉染步驟參考文獻[5]。

1.4.5 細胞周期分析

豬卵巢顆粒細胞轉染36 h后棄掉培養基，用預熱的PBS輕洗細胞，棄掉PBS，每孔細胞用1 mL預熱的胰酶消化懸浮細胞，再用培養基終止消化。1 000 r/min離心5 min，吸棄液體；用500 μL預冷的PBS輕洗細胞2次，用細胞周期檢測試劑盒中的RNase A溶液與碘化丙啶(PI)對細胞進行染色，利用細胞內DNA能夠和PI結合的特性，通過流式細胞儀檢測細胞各個時期的DNA含量。用Modifit軟件(Verity Software House公司)對細胞周期結果進行分析。

1.4.6 統計與分析

利用SPSS v20.0(IBM公司)軟件進行數據的統計分析，用t檢驗來評估統計學顯著性。用GraphPad Prism 5軟件 (GraphPad Software公司)制作柱形圖。所有試驗結果均以“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 豬miR-1307序列分析

豬miR-1307前體序列(cDNA)的長度為80 bp，其中堿基A、T、G和C的含量分別為16.25%、22.50%、30.00%和31.25%。序列分析發現豬miR-1307前體序列與人、牛、羊、黑猩猩和家犬等物種的一致性分別為53.02%、53.02%、53.2%、53.38%和75%(圖1)。豬miR-1307成熟序列為5′-ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG-3′，與人、牛、羊、黑猩猩和家犬等物種的一致性分別為100%、100%、95.65%、100%和100%。豬miR-1307種子序列(CUCGGCG)與哺乳動物其他物種完全一致，說明哺乳動物miR-1307序列高度保守。

染色體定位分析發現豬miR-1307定位于14號染色體，在基因組的114 325 624～114 325 703 nt之間，而人、牛、羊、黑猩猩和家犬等哺乳動物miR-1307則分別位于10、26、26、10和28號染色體上。進一步分析發現，哺乳動物miR-1307均位于編碼基因ATP5MD的轉錄起始位點與第1外顯子之間(圖2)，說明哺乳動物miR-1307基因定位也比較保守。

2.2 豬miR-1307 前體的二級結構分析

利用RNA structur在線軟件對豬miR-1307前體的二級結構預測與分析，發現豬miR-1307前體序列的最小折疊自由能(minimum free energy，MFE)小于-20 kcal/mol，并且能夠折疊形成典型的發夾結構。同時，結構預測發現miR-1307成熟序列位于發卡結構的臂上，符合miRNA的形成機制。

2.3 豬miR-1307功能預測

利用2種算法預測了miR-1307的靶基因，結果發現Targetscan預測的靶基因為1 693個，miRWalk預測的靶基因為6 924個，2種算法預測到的公共靶基因為567個共同的靶基因。利用DAVID軟件對miR-1307的靶基因進行功能富集分析。GO分析結果顯示，在生物學進程中，miR-1307的靶基因主要富集在rRNA分解代謝進程、炎癥反應和白細胞趨化性等通路中；在細胞組成上，miR-1307的靶基因主要與內質網、基底膜以及溶酶體的組成有關；在分子功能方面，miR-1307的靶基因主要參與蛋白酪氨酸磷酸酶活性、轉錄因子活性和外核糖核酸酶活性等過程(圖3)。KEGG通路分析顯示，miR-1307靶基因與催產素信號通路顯著相關(P<0.05)，雖然也富集到關于RNA降解和趨化因子信號途徑，但是相關性不顯著(圖4)。

has. 人；ssc. 豬；bta. 牛；chi. 羊；ptr. 猩猩；cfa. 家犬。下同

圖2 哺乳動物miR-1307染色體定位

1.rRNA分解代謝進程；2. 抗原刺激的炎癥反應；3. 白細胞趨化反應；4. 藥物反應；5. 干細胞生長因子受體信號；6. 4型過敏反應；7. 樹突狀細胞分化；8. 內質網；9. 基底膜；10. 溶酶體；11. 核外泌體；12. 核膜；13. 蛋白酪氨酸磷酸酶活性；14. 轉錄因子活性；15. 核糖核酸外切酶活性；16. ATP結合

圖4 miR-1307靶基因KEGG通路分析結果

2.4 過表達miR-1307對豬卵巢顆粒細胞周期的影響

為了分析miR-1307在卵巢顆粒細胞中的功能，將miR-1307 mimics轉染到體外培養的豬卵巢顆粒細胞中，利用FACS技術檢測顆粒細胞周期情況，結果如圖5。miR-1307過表達后豬卵巢顆粒細胞中G0/G1期細胞比例增加，而S期細胞比例顯著降低(P<0.05)，說明miR-1307過表達可抑制細胞S期DNA合成過程，導致豬卵巢顆粒細胞的G0/G1期阻滯。

2.5 抑制miR-1307對豬卵巢顆粒細胞周期的影響

為了進一步研究miR-1307在豬卵巢顆粒細胞周期中的作用，將miR-1307 inhibitor轉染到豬卵巢顆粒細胞中抑制miR-1307的表達，利用FACS技術檢測顆粒細胞周期情況，結果如圖6。抑制miR-1307后豬卵巢顆粒細胞中G0/G1期細胞比例減少(但未達顯著水平)，而S期細胞比例顯著增加(P<0.05)，說明抑制miR-1307可促進S期細胞DNA合成，預示豬卵巢顆粒細胞增殖水平增加。

A.對照組流式圖；B. miR-1307過表達組流式圖；C. 流式結果量化圖。*表示P<0.05。下同

A.對照組流式圖；B. miR-1307抑制組流式圖；C.流式結果量化圖

3 討論

眾所周知，miRNA是一類高度保守的內源性非編碼RNA[15]。本文通過miRNA序列分析發現， miR-1307的序列(特別是成熟序列和種子序列)和基因組定位在哺乳動物中均高度保守。這與前人對其他miRNAs的研究是一致的[2,5]。Du等[2]研究發現脊椎動物miR-126基因前體序列高度保守，成熟序列(UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG)和種子序列(CGUACCG)完全一致，且都定位于表皮生長因子樣結構域蛋白7(EGF like domain multiple 7，EGFL7)基因內含子區。Liu等[5]研究發現哺乳動物miR-26b基因前體序列高度一致(豬與小鼠、大鼠序列一致性為96.51%)，成熟序列(UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU)和種子序列(UCAAGUA)則完全一致，且都定位于編碼基因。另外，本文利用生物信息學軟件預測結合前人研究發現miR-1307的潛在靶基因參與調控多個生物學過程，如ISM1(isthmin 1)基因、DAB2互作蛋白(DAB2 interacting protein，DAB2IP)基因和B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL2)基因等。在結腸癌細胞中，ISM1已被證實是miR-1307的功能靶基因，miR-1307可靶向調控ISM1基因進而影響凋亡相關基因如Caspase3、周期相關基因如細胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)以及增殖相關基因Ki67的蛋白水平，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，并使細胞周期阻滯在G1期[16]。在肝癌細胞中，顯著上調的miR-1307能夠靶向抑制DAB2IP來促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲[17]。在我們預測的miR-1307潛在靶基因中，BCL2和X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是細胞凋亡標志基因，是哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡的重要抑制因子[5,7,9,18-19]。另外，本文通過KEGG功能富集分析發現miR-1307靶基因還富集在催產素信號通路中，其中CD38是促進催產素分泌的關鍵因子[20-21]；而原癌基因SRC的活化介導了表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)放大催產素信號溶解黃體的過程[22]。綜上所述，豬miR-1307與其他哺乳動物高度保守，可能與其他哺乳動物miR-1307一樣，在眾多生物學進程中發揮著重要作用。

在真核生物中，細胞周期一般包括4個階段，G1期、S期、G2期和M期(有絲分裂期)。miRNAs與細胞周期密切相關，研究證實miRNAs可通過調節各個階段的關鍵細胞周期蛋白及其調節因子的表達來調節細胞周期進程[23]。例如，在人類乳腺癌細胞中，miR-17/20通過靶向抑制細胞周期蛋白CCND1來影響細胞周期進程[24]。Let-7的低表達通過直接或間接影響細胞周期調節因子如周期依賴性激酶4/6(cyclin dependent kinase 4/6，CDK4/6)和細胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，CDC25A)的表達，改變肺癌細胞的細胞周期進程和增殖，進而誘導其有絲分裂[25]。miR-30a和miR-145通過作用于多種癌細胞中周期相關基因，影響多發癌患者的生存率[26]。在正常細胞如牛肌細胞中，肌肉特異性表達的miR-208b通過靶向抑制周期相關基因CDK抑制劑1A(CDK inhibitor 1A，CDKN1A)，進而影響細胞周期和增殖[27]。在牛卵巢顆粒細胞中，miRNA-183-96-182簇通過靶向抑制叉頭框蛋白O1(forkhead box O1，FOXO1)基因，調控細胞增殖和細胞周期[14]。本文研究發現，過表達或抑制miR-1307可影響豬卵巢顆粒細胞周期進程，首次證實miR-1307與哺乳動物卵巢顆粒細胞的細胞周期有關。研究發現，miR-1307是細胞周期的重要表觀調節因子，在前列腺癌細胞中miR-1307通過靶向叉頭框蛋白O3A(forkhead box O3A，FOXO3A)基因的3′-UTR抑制FOXO3A的表達水平，進而下調其下游基因即細胞周期抑制因子p21和p27的表達，從而影響細胞增殖與細胞周期[28]。總之，本文研究表明在豬卵巢顆粒細胞中，miR-1307是調控細胞周期的關鍵miRNA。但是，miR-1307通過調控下游靶基因影響豬卵巢顆粒細胞周期的分子機制還有待進一步研究。