漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態性及單倍型的分布特征*

白 微，葉 瑾，奚經巧，2，林 枝，蔡文品，2△

(浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院：1.檢驗科；2.中醫藥科研實驗中心，浙江溫州 325000)

人類白細胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)位于人類第6號染色體短臂上，是一群緊密連鎖基因群，屬于人類非經典的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子。HLA-G包括編碼區和非編碼區(untranslated region，UTR)，HLA-G 3′UTR富含AU的基序，聚腺苷酸信號和微RNA(microRNA，miRNA)結合位點，不同于編碼區的低多態性，UTR呈現出高度的多態性。HLA-G 3′UTR的基因多態性與HLA-G表達的轉錄后調控有關，該區域約有30個多態性位點[1]，研究最多的是14 bp插入/缺失，與HLA-G mRNA的穩定性有關[2]。其他的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點還有+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G等，被證實與mRNA降解和miRNA結合有關[2]。正常生理條件下，HLA-G分子僅在母胎界面的絨毛外滋養層細胞、胸腺、胰島及間充質干細胞等少數免疫豁免組織表達[3]。HLA-G特異性高表達于絨毛外滋養層細胞，參與母胎界面免疫耐受的誘導和維持[4]，許多研究表明HLA-G基因多態性與復發性流產、先兆子癇等病理妊娠有較大相關性[3]。HLA-G 3′UTR基因多態性與妊娠相關的研究多集中在14 bp插入/缺失，其他位點的研究甚少，且有研究表明不同地區不同種族人群HLA-G 3′UTR基因多態性存在異質性[5]。因此，本研究分析了本地區HLA-G 3′UTR多個位點在健康妊娠婦女中的分布特點，為本地區健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態性的分布提供試驗數據，為后續妊娠相關疾病的研究打下基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年10月至2018年10月本院產前檢查婦女168例，年齡18～41歲，平均(27.1±4.3)歲，均為漢族，無高血壓、糖尿病、腎臟疾病等基礎疾病，無糖尿病、高血壓等妊娠期并發癥。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準(批準號：WTCM-H-2017035)。

1.2 方法

1.2.1樣品采集與處理

平靜狀態下選取合適的肘靜脈，用美國BD公司生產的采血管采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血2～3 mL，-80 ℃保存，用于血液全基因DNA提取。

1.2.2外周血液全基因DNA提取

采用天根生化科技(北京)有限公司生產的全基因組DNA提取試劑盒提取血液全基因DNA，所有操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用NanoDrop One核酸濃度分析儀測定提取的DNA濃度和純度。

1.2.3HLA-G 3′UTR基因PCR擴增

利用Primer Premier5.0軟件進行PCR引物設計，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列HLA-G-3′UTR正向：5′-GTG GGT TGT TGA GGG-3′；HLA-G-3′UTR反向:5′-GTC TTC CAT TTT TGT CTC T-3′，擴增產物500 bp。根據PCR試劑說明書調整擴增條件，采用25 μL體系Taq MasterMix 13 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水(ddH2O)8 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃長延伸10 min，步驟變性-步驟延伸進行35個循環。

1.2.4PCR擴增產物電泳

配制1.5%瓊脂糖(上海Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇貿易有限公司)凝膠，Goldview染色(北京索萊寶科技有限公司)，將PCR擴增產物上樣，120 V恒壓電泳15 min，凝膠成像儀拍照記錄。檢測擴增產物，500 bp處出現亮帶表明擴增成功，進行下一步測序。

1.2.5Sanger測序

將PCR擴增產物送至杭州擎科生物技術有限公司進行Sanger測序，測得的序列利用CodonCode Aligner軟件比對分析，確定基因型。

1.3 統計學處理

采用SPSS22.0統計軟件進行Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗，P>0.05表示處于H-W平衡；SHEsis在線軟件直接統計基因型和等位基因頻率，進行連鎖不平衡分析和單倍型分析。

2 結 果

2.1 H-W平衡檢驗

HLA-G 3′UTR 8個多態性位點H-W平衡檢驗結果見表1，結果顯示，14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G 8個位點的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，該人群處于H-W平衡狀態，樣本具有本區域群體代表性。

表1 HLA-G 3′UTR基因多態性位點H-W平衡檢驗

2.2 HLA-G 3′UTR基因型與等位基因頻率分布

8個多態性位點基因型和等位基因頻率分布見表2，結果顯示，14 bp ins/del位點以del等位基因和del/del基因型為主，占比分別為81.0%和65.5%；+3003C/T位點T等位基因和TT基因型占大多數，占比分別為99.4%和98.8%，未發現CC基因型；+3010G/C位點以G等位基因和GC基因型為主，占比分別為56.8%和47.0%；+3027C/A位點以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為82.7%和68.4%；相似地，+3035C/T位點以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為82.1%和67.3%；+3142C/G位點以C等位基因和CG基因型為主，占比分別為59.2%和51.8%；+3187A/G位點以G等位基因和AG基因型為主，占比分別為56.0%和47.6%；+3196C/G位點以C等位基因和CC基因型為主，占比分別為99.7%和99.4%，未發現GG基因型。

表2 HLA-G 3′UTR基因多態性位點等位基因和基因型分布(n=168)

2.3 HLA-G 3′UTR基因多態性位點連鎖不平衡及單倍型分析

8個多態性位點的連鎖不平衡分析應用SHEsis軟件，用連鎖不平衡系數D′進行檢驗分析，D′>0.7認為是強連鎖，結果見圖1(數值表示百分數，越接近1.0表示兩個位點連鎖越緊密，顏色越深表示兩個位點連鎖越緊密)。結果顯示，除+3003C/T與14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T外，其他D′值均大于0.7，認為這8個位點緊密連鎖，可以構建單倍型。

圖1 HLA-G 3′UTR 8個基因多態性位點間的連鎖不平衡分析情況

SHEsis結果顯示，8個基因多態性位點可以構建14個單倍型，對常見的頻率較高的7個單倍型進行統計，分別是UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-2(ITC CCG AG)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-4(DCG CCC AC)、UTR-5(ITC CTG AC)、UTR-6(DTG CCC AC)、UTR-7(ITC ATG AC)，單倍型組成從左到右為14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，見表3。UTR-1，UTR-3，UTR-7頻率大于0.03，三者共占94.3%(317/336)，分別占55.0%、23.8%、15.5%，其中UTR-1超過半數以上。

表3 HLA-G 3′UTR多態性位點單倍型分析

3 討 論

HLA-G基因位于人染色體6p23.1，全長6.0 kb，由8個外顯子和7個內含子組成，從部分6號外顯子開始延伸至多聚A尾巴前端，包括7號外顯子、8號外顯子的區域被稱為3′UTR[6]。HLA-G 3′UTR基因多態性調控了HLA-G的表達水平，與多種臨床疾病有關，從對妊娠期HLA-G的研究開始，該領域就關注了HLA-G在惡性和炎癥性疾病中的表達及其可能的重要性，以及在心臟和肝/腎器官移植中的應用。HLA-G選擇性高表達于絨毛外滋養細胞，促進母胎界面免疫耐受狀態的維持[7]。HLA-G 3′UTR參與穩定轉錄本，影響mRNA的翻譯水平和分子表達，改變疾病的遺傳易感性[8-10]。有研究報道，HLA-G與復發性流產、先兆子癇等病理妊娠有較大相關性[11-12]，但多項研究結果具有一定爭議性，這可能是由于基因多態性與種族、地區、環境有關。因此，調查本地區的HLA-G 3′UTR位點基因多態性分布特點，分析基因多態性位點之間的連鎖不平衡和單倍型具有一定必要性。

本研究通過檢測分析溫州地區漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR 8個基因多態性位點：14 bp ins/del，+3003C/T，+3010G/C，+3027C/A，+3035C/T，+3142C/G，+3187A/G，+3196C/G，發現8個基因多態性位點具有各自的分布特征，以純合子基因型為主的位點如14 bp ins/del、+3027C/A、+3035C/T，以雜合子基因型為主的位點如+3010G/C、+3142C/G、+3187A/G；而+3003C/T、+3196C/G未檢測到CC和GG基因型。SNPs在人類基因組中廣泛存在，占所有已知基因多態性的90%以上，具有穩定遺傳的特點。某些SNPs雖然與疾病無關，但是因為與致病基因相鄰或者多個SNPs的聯合效應對疾病產生重要影響。近年來，越來越多的研究關注了聯合檢測SNPs構建單倍型對疾病的影響。本研究連鎖不平衡分析發現，8個基因多態性位點緊密連鎖，在對常見的8個單倍型統計分析發現溫州地區妊娠婦女單倍型的分布特征，UTR-1、UTR-3、UTR-7單倍型頻率大于0.03，三者共占94.3%，其中UTR-1超過半數以上，是溫州地區妊娠婦女主要的單倍型。

LUCENA-SILVA等[13]研究了巴西南部和北部健康人群HLA-G 3′UTR分布，發現在+3003CT、TT基因型的分布有明顯差異，說明同種族不同區域基因多態性位點的分布存在差異；與本研究相比，在多個位點具有差異，巴西人群14 bp位點以雜合子del/ins為主，本研究結果以純合子del/del為主；巴西人群以+3142G等位基因為主，而本研究以+3142C等位基因為主；巴西人群以+3187A等位基因、AA純合子基因型為主，而本研究以+3187G等位基因、AG雜合子基因型為主。新西蘭健康育齡婦女HLA-G 3′UTR基因多態性位點的分布[14]與本研究相似，但在新西蘭健康育齡婦女中未發現+3027AA基因型。研究報道，14 bp ins/del位點基因多態性影響HLA-G mRNA的穩定性，可能與miRNA結合位點的破壞有關[2]。+3027C/A、+3142C/G、+3187A/G等SNP位點也都是miRNA的結合位點，或與AU富集區有關，位點的多態性影響miRNA的穩定性和降解速度，以此在轉錄后調節HLA-G的表達[9]。單倍型分布特點上，巴西人群UTR-1、UTR-2、UTR-3占多數[13]，分別為29.5%、22.8%、15.8%，與本研究結果不同；新西蘭健康育齡婦女的單倍型以UTR-1、UTR-2、UTR-4為主[14]，分別為33.3%、26.0%、19.8%，雖然等位基因和基因型與本研究結果相似，但是單倍型卻不同。已有報道顯示，HLA-G 3′UTR單倍型與先兆子癇[15]、復發性流產[16]、敗血癥[17]等有一定關聯性。HLA-G 3′UTR單倍型與HLA-G的表達有關，UTR-1與高水平表達相關，UTR-5、UTR-7與低水平表達相關[18]，UTR-2/3/4/6與中等水平表達相關。各種族各地區不同人群在基因多態性及單倍型的分布差異可能是疾病分布不同的原因，育齡婦女與其他人群具有不同的HLA-G 3′UTR基因多態性和單倍型分布，不同地區育齡婦女的分布也不盡相同。以健康妊娠婦女為代表調查本地區健康育齡婦女的HLA-G 3′UTR基因多態性分布，可以更好地為妊娠期并發癥的研究打下基礎，深入了解HLA-G 3′UTR在妊娠中的作用。

綜上所述，本研究中溫州地區漢族健康妊娠婦女HLA-G 3′UTR基因多態性位點的基因型和等位基因、單倍型的分布特征明顯，等位基因以14 bp del、+3003T、+3010G、+3027C、+3035C、+3142C、+3187G、+3196C為主，基因型以14 bp del/del、+3003TT、+3010GC、+3027CC、+3035CC、+3142CG、+3187AG、+3196CC為主，單倍型以UTR-1(DTG CCC GC)、UTR-3(DTC CCG AC)、UTR-7(ITC ATG AC)為主，UTR-1是最主要的單倍型。后續將進一步深入研究HLA-G 3′UTR基因多態性及單倍型在妊娠并發癥如先兆子癇、復發性流產等的意義，以及與mRNA和miRNA相關的分子機制。