維生素D受體基因多態性與青少年代謝綜合征空腹血糖受損的關系研究

曹 涵，張 文

(上海市松江區中心醫院內分泌科，上海 201600)

青少年代謝綜合征(adolescent metabolic syndrome，MS)已成為全球發病率非常高的，以肥胖、高血糖、血脂代謝異常為特征的一組臨床癥候群[1]。MS與心血管疾病、2型糖尿病的發生發展密切相關。胰島素抵抗是MS發生的病理基礎。研究顯示，空腹血糖受損(impaired fasting glucose，IFG)與胰島素抵抗密切相關，尤其是當空腹血糖高于6.1mmol/L時胰島素抵抗更加嚴重[2]，而IFG增高則更有可能導致糖尿病的發生發展[3]。

眾所周知，維生素D水平與兒童青少年生長發育密切相關。目前國外已有研究發現，維生素D水平降低與青少年肥胖、血糖升高、血脂異常及胰島素抵抗密切相關[4-5]。但是目前國內對于維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)基因多態性與MS空腹血糖受損的關系研究報道較少?；诖?，本研究擬探討維生素D受體基因多態性與MS患者維生素D水平及空腹血糖受損之間的關系，以期進一步分析和闡明維生素D在MS進展為糖尿病中的作用，為臨床采取更為有效的治療手段提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年3月至2019年8月在上海市松江區中心醫院接受治療的青少年代謝綜合征患者242例作為MS組。MS的診斷標準符合2012年中華醫學會兒科分會內分泌遺傳代謝學組、心血管學組及兒童保健學組共同推出的有關中國青少年MS定義的診斷標準[6]：年齡10～16歲，腰圍(waist circumference，WC)≥中國兒童青少年同年齡同性別的第90百分位數節點值，同時還應具備至少以下兩項：①空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥5.6mmol/L或已診斷為2型糖尿病；②收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥130mmHg或舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)≥85mmHg；③高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)<1.03mmol/L；④空腹甘油三酯(triglycerides，TG)≥1.70mmol/L。納入標準：①近3個月體重穩定；②除在學校進行體育活動以外，無規律性的運動習慣及活動；③家屬簽署知情同意書。排除標準：①有心血管事件者；②繼發性肥胖、繼發性高血壓、腎臟性疾病、血脂紊亂以及嚴重肝腎功能不全者；③正在服用影響血壓、肝功能、血糖、血脂以及維生素D水平的藥物。其中男孩136例，女孩106例；年齡11～16歲，平均年齡(12.56±2.47)歲。MS組患者根據是否出現空腹血糖受損分為IFG亞組(n=72)和Non-IFG亞組(n=170)，IFG亞組空腹血糖6.1～7.0mmol/L，符合空腹血糖受損的診斷標準[7]。另選取同期在我院體檢中心健康檢查的青少年(NC組)200例，其中男孩113例，女孩87例；年齡10～16歲，平均年齡(12.17±2.26)歲。兩組性別、年齡等一般資料具有可比性(均P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會審核。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料及生化指標

收集各研究對象性別、年齡、身高、體重、腰圍，計算體質指數(body mass index，BMI)。禁食10～12h后于次日清晨7:00至8:00，抽取各受試對象肘靜脈血，檢測FPG、空腹胰島素(fasting insulin，Fins)、糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)、穩態模型胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。采用全自動化分析儀檢測血脂指標：TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。采用酶聯免疫試劑盒檢測血清中1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2D3]。

1.2.2 PCR-RFLP技術檢測VDR基因ApaⅠ位點多態性

將獲得的受試對象血樣標本250μL置于含有EDTA的EP管中，采用Axygen全血基因組DNA提取試劑盒提取樣本中DNA，并保存于-80℃冰箱中備用；采用PCR-RFLP技術檢測VDR基因ApaⅠ位點多態性。引物以及探針經Primer Express 2.0軟件進行設計，并經上海生工生物科技有限公司合成。上游引物序列：5′-CGCGTACGATCGCTGGCTAGC-3′，下游引物序列：5′-GGCGATCGACTAAGTACGCTACTAC-3′。PCR擴增體系為25L，其中含有5L PCR緩沖液，上游及下游引物各0.5L，5U/L Taq DNA聚合酶0.25L，2.5mmol/L的dNTPs 4.0L，剩余加入雙蒸水。SCN5A基因C5457T位點的擴增反應條件為：94℃預變性2min，而后按照94℃30s、59℃30s、62℃15s的順序進行40個循環，最后以62℃延伸1min。PCR擴增產物經限制性內切酶酶切反應2h，而后在ABI-7500 fast RT-PCR電泳儀上進行反應，抽取10%的樣本進行基因測序，從而確定基因分型檢測的準確性。

1.3統計學方法

2結果

2.1各組對象臨床資料比較

研究結果顯示，MS組各亞組BMI、SBP、DBP、FPG、Fins、HbA1c、TG、HDL-C、HOMA-IR、1,25-(OH)2D3與NC組比較差異有統計學意義(F/χ2值分別為9.574、6.632、6.417、7.836、12.369、8.254、7.884、7.994、11.334、12.417，均P<0.05)，詳見表1。

表1 MS亞組與NC組臨床資料比較

2.2 VDR基因ApaⅠ擴增結果

擴增條帶經凝膠電泳分析顯示，純合子(AA型)為一條明亮的條帶(740bp)、雜合子(Aa)有三條帶(740bp、530bp和210bp)，純合子(aa)為兩條帶(530bp、210bp)，見圖1。

圖1 VDR基因ApaⅠ酶切電泳結果

2.3各組對象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布頻率

研究結果顯示，VDR基因ApaⅠ位點三種基因型及A、a等位基因頻率在NC組、Non-IFG亞組及IFG亞組中符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。三組研究對象VDR基因ApaⅠ基因型及等位基因分布頻率比較差異具有統計學意義，且aa基因型頻率、a等位基因頻率均在IFG亞組中最高，在NC組中最低(χ2值分別為36.954、31.501，均P<0.01)，見表2。

表2 兩組患者VDR基因ApaⅠ基因頻率與等位基因頻率分布[n(%)]

2.4 IFG亞組不同基因型患者臨床生化指標比較

研究顯示，不同基因型患者FPG、HbA1c、Fins、HDL-C、1,25-(OH)2D3比較差異有統計學意義，且aa基因型患者的FPG、HbA1c、Fins水平更高，HDL-C、1,25-(OH)2D3水平更低(F值分別為6.278、5.536、9.663、6.012、11.547，均P<0.05)，見表3。

表3 VDR基因ApaⅠ不同基因型臨床生化指標比較

2.5青少年代謝綜合征空腹血糖受損的危險因素分析

以MS患者中是否出現空腹血糖受損作為因變量(是為1，否為0)，以Non-IFG亞組及IFG亞組比較差異有統計學意義的因素作為自變量行Logistic回歸分析，結果顯示，BMI、FPG、HbA1c、HOMA-IR、aa基因型及a等位基因為MS患者空腹血糖受損的危險因素，HDL-C及1,25-(OH)2D3為MS患者空腹血糖受損的保護因素，其OR值及95%CI分別為2.416(1.397～6.222)、2.978(1.694～8.996)、1.896(1.207～7.554)、2.021(1.832～7.449)、2.142(1.214～8.094)、2.423(1.353～7.939)、0.421(0.384～0.852)、0.527(0.436～0.847)，均P<0.05，見表4。

表4 青少年代謝綜合征血糖受損的危險因素分析

3討論

3.1維生素D水平與兒童代謝綜合征的關系

維生素D水平與兒童青少年機體鈣磷代謝及肥胖發生密切相關。研究顯示，兒童青少年血維生素D水平降低與血糖升高、胰島素抵抗存在相關性，且易導致血壓、血脂異常[8]。維生素D在血液循環中主要以25-羥基維生素D的形式存在，在腎臟轉化為具有生物活性的1,25-二羥基維生素D。需要指出的是，目前對于維生素D如何影響糖代謝的作用機制尚不明確。現有的研究發現，維生素D可以通過肌肉、肝臟以及胰島細胞上的維生素D受體調節細胞內鈣離子濃度以及對炎癥因子的釋放產生作用從而直接或者間接影響胰島素敏感性以及胰島β細胞功能[9]。通過本研究發現，MS患者IFG亞組血清中1,25-(OH)2D3水平、HOMA-IR，與對照組、無IFG亞組比較差異有統計學意義，提示MS空腹血糖受損患者存在明顯的維生素D水平降低和胰島素抵抗，也進一步闡明了維生素D對于維持胰島β細胞功能的影響及對血糖的調節作用。

3.2維生素D水平與其受體基因多態性的關系

維生素D水平受到環境、地理位置、季節飲食及遺傳等因素的影響，其中遺傳因素是重要的影響環節之一[10]。維生素D受體基因多態性與兒童青少年維生素D水平已經成為研究的熱點，而維生素D受體基因位點研究熱點主要集中在FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ等基因位點上[11-12]。但需要指出的是，不同的研究得出的結論不盡相同。國外一項研究顯示，維生素D受體基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ位點與維生素D水平無關[13]，但另有研究卻顯示維生素D受體基因FokⅠ、BsmⅠ、TaqⅠ與維生素D缺乏呈顯著相關[14]。不同的研究結果可能與不同的種族、地理環境等因素有關。盡管國外研究顯示，不同維生素D基因位點與兒童青少年肥胖、血脂及血壓升高乃至胰島素抵抗均在一定程度上存在相關性[15-16]，但需要指出的是目前國內對于探討維生素D受體基因多態性青少年代謝綜合征患者的關系，尤其是空腹血糖受損之間的關系研究尚少。通過本研究發現，MS組患者各亞組與NC組比較存在維生素D受體基因ApaⅠ基因位點表達差異，經多因素Logistic回歸分析顯示，aa基因型及a等位基因為MS患者空腹血糖受損的危險因素，說明青少年代謝綜合征患者維生素D受體基因多態性與空腹血糖受損存在相關性，臨床需要密切關注維生素D受體基因多態性與青少年代謝綜合征疾病之間的關系。

3.3維生素D及其受體基因多態性與遠期心血管事件的關系

維生素D水平與MS患者及遠期心血管事件有著一定關系，影響維生素D水平的因素很多，如飲食習慣、地理環境、遺傳等[17]。目前，國內對于這一關系的研究尚缺乏足夠的證據。通過本研究發現，aa基因型患者維生素D水平明顯低于AA基因型、Aa基因型，多因素Logistic回歸分析顯示維生素D水平是影響MS患者空腹血糖受損的影響因素。因此，筆者認為，一是aa基因型患者可能通過降低維生素D水平導致MS患者空腹血糖受損，因此建議臨床治療MS時需調整治療方案，適當加入維生素D制劑；二是需要進一步深入研究維生素D受體基因影響空腹血糖受損的機制，以進一步闡明維生素D在MS及糖尿病中的發生機制。

綜上，維生素D受體基因ApaⅠ位點多態性與MS患者空腹血糖受損存在一定相關性，其可能通過降低維生素D受體水平引起MS空腹血糖受損。