高產L-乳酸酸菜菌種篩選及發酵條件優化

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000）

酸菜是酸漬大白菜的簡稱，指在低濃度食鹽條件下，經過乳酸菌發酵而形成的蔬菜發酵制品，是我國東北地區傳統發酵食品之一[1-3]。酸菜的制作過程其實就是乳酸菌利用白菜作為培養基發酵產生乳酸的過程。乳酸是一種重要的多用途有機酸，可廣泛應用于食品、醫藥、化工、制革、紡織、環保和農業等諸多領域，按其構型及旋光性可分為L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸三類[4-6]。醫學研究證明，人體只具有代謝L-乳酸的酶（L-乳酸脫氫酶），只能代謝L-乳酸，而D-乳酸進入人體后由于不能代謝會使血尿酸度提高，過量地攝入就會引起代謝紊亂，造成酸中毒等不良反應，危害人體健康[7-8]。世界衛生組織明確規定，成人每天攝入D-乳酸的量不得超過100 mg/kg體重，3個月以下的嬰兒食品中不應加入D-乳酸，而對于L-乳酸則不加限制[9-10]。傳統酸菜發酵產物多為D-乳酸，因此，就需要對傳統酸菜進行改良，要篩選出高產L-乳酸、生長性能好、產酸力強的優良菌株[11-14]，才能更好地滿足廣大消費者對食品安全性的要求。

本文從自然發酵酸菜汁中篩選高產L-乳酸的乳酸菌，并用響應面法對其發酵條件進行優化，為生產出安全優質的酸菜提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

自然發酵酸菜：市售。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、瓊脂、檸檬酸二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；D/L-乳酸檢測試劑盒（D/L-lactic acid assay lit）：愛爾蘭 Megazyme公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基 ：牛肉膏10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉2.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫 80 1.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、瓊脂粉 15.0 g、水 1.0 L，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.1.4 主要儀器設備

離心機（Z-16PK）：Sigma公司；高壓滅菌鍋（SX-500）：TDMY KOGYO 公司；電子分析天平（JA2003）：上海越平科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫培養箱（GSP-9080MBE）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 產L-乳酸乳酸菌的分離和純化

將自然發酵酸菜的酸菜汁液稀釋至10-7，涂于MRS平板培養基，32℃恒溫培養2 d～4 d。挑選單菌落進行分離純化。純化后的菌株分別接到液體MRS培養基中，32℃靜置培養24 h，進行L-乳酸檢測[15]，按D/L-乳酸檢測試劑盒步驟進行。產L-乳酸的菌株作為以下試驗目標菌。

1.2.2 發酵條件優化

1.2.2.1 發酵時間對乳酸菌數和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發酵培養基中，于32℃條件下培養 14、16、18、20、22、24 h 及 26 h 后測發酵液的菌數和L-乳酸產量。

1.2.2.2 發酵溫度對乳酸菌數和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發酵培養基中，設28、30、32、34、36、38℃6個溫度條件，培養20 h后測發酵液的菌數和L-乳酸產量。

1.2.2.3 接種量對乳酸菌數和L-乳酸產量的影響

將菌株按1%、2%、3%、4%、5%接種到發酵培養基中，在32℃條件下培養20 h后測發酵液的菌數和L-乳酸產量。

1.2.2.4 初始pH值對乳酸菌數和L-乳酸產量的影響

將菌株按3%接種到發酵培養基中，設定培養基初始 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5，在 32 ℃條件下培養20 h后測發酵液的菌數和L-乳酸產量。

1.2.2.5 Box-Behnken響應面試驗

根據單因素試驗結果，選取對產L-乳酸影響顯著的因素水平，以L-乳酸產量為響應值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平Box-Behnken響應面試驗[16-19]，具體方案如表1所示。

表1 響應面因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

2 結果與分析

2.1 產L-乳酸乳酸菌的分離和純化

從自然發酵的酸菜汁中分離得到4株乳酸菌，分別命名為 LZH-1、LZH-2、LZH-3和 LZH-4，通過產 L-乳酸檢測發現，只有LZH-3產L-乳酸。L-乳酸產量為22.52 g/L。LZH-3的菌落形態和菌體形態見圖1。

圖1 LZH-3的菌落形態和菌體形態Fig.1 The colony morphology and microscopic morphology of LZH-3

2.2 發酵條件優化試驗結果

2.2.1 發酵時間對菌數和L-乳酸產量的影響

發酵時間對菌數和L-乳酸產量的影響見圖2。

圖2 發酵時間對菌數和L-乳酸產量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on bacteria number and L-lactate production

如圖2所示，在接種后14 h～20 h內，LZH-3快速生長，L-乳酸產量也隨之增長，這時LZH-3處于對數生長期，生長代謝都處于旺盛期，發酵到20 h菌數達到最高，L-乳酸產量也達到最高值22.32 g/L，之后隨著發酵時間的延長，菌數趨于平衡，L-乳酸產量基本沒有變化，這是因為LZH-3進入生長穩定期，代謝達到平衡，這與該菌的生長曲線相吻合。

2.2.2 發酵溫度對菌數和L-乳酸產量的影響

發酵溫度對菌數和L-乳酸產量的影響見圖3。

圖3 發酵溫度對菌數和L-乳酸產量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on bacteria number and L-lactate production

從圖3可以看出，隨著發酵溫度的升高，菌株LZH-3菌數和L-乳酸產量都隨之增加，到32℃時生長代謝最為旺盛，菌數和L-乳酸產量達到最高，再隨著溫度升高生長繁殖受到抑制，同時代謝能力也衰退，菌數和L-乳酸產量都呈下降趨勢。故確定LZH-3最適宜的發酵溫度和產L-乳酸溫度為32℃。

2.2.3 接種量對菌數和L-乳酸產量的影響

接種量對菌數和L-乳酸產量的影響見圖4。

圖4 接種量對菌數和L-乳酸產量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the number of bacteria and L-lactate production

從圖4可以得到，隨著接種量的增加，菌數和L-乳酸產量均增加，但當接種量超過3%的時候，菌數和L-乳酸產量都略有下降，應該是由于接種量過多導致養分不足，菌的繁殖受到限制，從而影響了L-乳酸的產量。綜合上述結果確定LZH-3的最適接種量為3%。

2.2.4 初始pH對菌數和L-乳酸產量的影響

初始pH值對菌數和L-乳酸產量的影響見圖5。

圖5 初始pH值對菌數和L-乳酸產量的影響Fig.5 Effect of initial pH on bacteria number and L-lactate production

如圖5所示，隨著初始pH值的增加，菌數和L-乳酸產量都成增加趨勢，到pH值為6時菌數和L-乳酸產量達到最高。在初始pH值在6～6.5的條件下，菌株LZH-3的菌數和L-乳酸產量均可保持在一個較高的水平。初始pH值繼續升高，菌數和L-乳酸產量迅速下降，因此菌株LZH-3生長繁殖及產L-乳酸的最適宜pH值是6。故菌株LZH-3的發酵初始pH值選擇6。

2.2.5 響應面法優化發酵條件

2.2.5.1 模型建立及顯著性分析

以L-乳酸產量為響應值，運用Box-Benhnken設計29組試驗。Box-Benhnken試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken

續表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Coutinue table 2 Expeiment design and results of Box-Benhnken

用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的結果進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為Y=26.51+0.74A+1.32B+4.5C+2.93D-0.55AB+1.28AC-0.87AD-0.64BC-0.16BD-0.56CD-2.33A2-1.78B2-4.78C2-3.25D2。方差分析結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

該模型的決定系數R2=0.986 5，校正決定系數R2Adj=0.973 0，說明試驗的實際值和預測值擬合度比較好。由表3可以看出，從對L-乳酸產量的影響來看，一次項A、B、C、D對產L-乳酸的影響均達到極顯著水平，影響順序為C＞D＞B＞A，即發酵溫度＞初始pH值＞發酵時間＞接種量。該回歸模型P＜0.000 1，表明試驗所采取的二次模型極顯著，失擬項的P=0.053 7＞0.05，模型失擬項不顯著，表明該模型在統計學上是有意義的。模型中 A、B、C、D、AC、A2、B2、C2、D2，對 L-乳酸的產量影響極顯著（P＜0.01）。AD對L-乳酸的產量影響顯著（P＜0.05）。交互項AB、BC、BD、CD 對L-乳酸的產量無顯著性影響（P＞0.05）。

2.2.5.2 響應面交互作用分析

通過Design-Expert8.0.6軟件，做出兩因素之間交互作用的3D響應面曲線圖見圖6。

圖6b曲面傾斜度比較大，且越接近曲面頂端時，顏色愈深，表示變化越急劇，作用越明顯，說明相關兩因素間交互作用顯著。其中圖6c曲面變化度尤為明顯，說明交互作用顯著。而圖6adef中曲面的變化相對平緩，說明相關兩因素間交互作用不明顯。交互效應強弱程度也可從等高線的形狀中觀察，圓形為交互作用不顯著，橢圓則為交互作用顯著[20]。

圖6 兩因素交互作用3D響應面曲線Fig.6 3D Response surface curve of interaction between factors

2.2.5.3 產L-乳酸試驗的優化與驗證

通過Design-Expert8.0.6軟件優化后的最佳產L-乳酸的發酵條件：接種量為3.18%，發酵時間為20.49 h，發酵溫度為32.91℃，初始pH值為6.19，此時預測L-乳酸產量為28.33 g/L。為方便實際的操作，將發酵條件調整為接種量3%，發酵時間20 h，發酵溫度33℃，初始pH 6.2，按此條件進行試驗，重復3次取平均值，測得L-乳酸產量為28.17 g/L，與預測值的相對誤差為0.56%，說明方程擬合較好，響應面優化得到的發酵參數準確，具有實用價值。

3 結論

從自然發酵酸菜汁中分離得到4株乳酸菌，將其中一株產L-乳酸的菌株編號為LZH-3。通過響應面法對其液體發酵條件進行優化，得出最佳發酵條件：發酵溫度為33℃、接種量為3%，初始pH值為6.2，發酵時間為20 h。在此優化條件下L-乳酸產量為28.17 g/L，是優化前的1.25倍。本研究為此乳酸菌大規模工業化生產優質酸菜提供了重要的理論依據。